Följande procedur beskriver en metod för rumslig och temporal kontroll av melanocytisk tumör initiering i murina dorsala hud, med hjälp av en genetiskt modifierade mus modell. Detta protokoll beskriver makroskopisk och mikroskopisk kutan melanom initiering.
Kutan melanom är välkänd som den mest aggressiva hud cancer. Även om riskfaktorer och stora genetiska förändringar fortsätter att dokumenteras med ökande djup, incidensen av kutan melanom har visat en snabb och kontinuerlig ökning under de senaste decennierna. För att hitta effektiva förebyggande metoder, är det viktigt att förstå de tidiga stegen av melanom initiering i huden. Tidigare data har visat att follikulära melanocytstamceller (MCSCs) i de vuxna hud vävnaderna kan fungera som melanom celler av ursprung när de uttrycker onkogena mutationer och genetiska förändringar. Tumorigenesis till följd av melanom-benägna MCSCs kan induceras när MCSCs över gång från en quiescent till aktivt tillstånd. Denna över gång i melanom-benägen mcscs kan främjas genom modulering av antingen hår säckar stamceller verksamhet stat eller genom yttre miljö faktorer såsom ultraviolett-b (UV-b). Dessa faktorer kan artificiellt manipuleras i laboratoriet genom kemisk depilation, som orsakar över gång av hår säckar stamceller och MCSCs från en quiescent till aktivt tillstånd, och genom UV-B exponering med hjälp av en bänk ljus. Dessa metoder ger framgångs rik rumslig och temporal kontroll av kutan melanom initiering i murina dorsala huden. Därför, dessa in vivo modell system kommer att vara värdefullt att definiera de tidiga stegen av kutan melanom initiering och kan användas för att testa möjliga metoder för tumör prevention.
Melanom, den elakartade formen av melanocytiska tumörer, är den mest aggressiva cancer i huden med kutan melanom som ansvarar för majoriteten av hud cancer dödsfall1. I USA, melanom är allmänt diagnostiseras; Det beräknas vara den 5: e till 6: e vanligaste cancer typ bland de uppskattade nya cancer fall i 20182. Dessutom, medan den totala cancer incidensen har visat trenden med gradvis minskning under de senaste decennierna, kutan melanom incidens under de senaste decennierna visar en kontinuerlig och snabb ökning av båda könen2.
För att bekämpa kutana melanom mer effektivt, är det viktigt att tydligt förstå de tidiga händelserna av melanom utveckling från sina ursprungs celler för att bättre identifiera kliniskt effektiva förebyggande metoder. Det är nu känt att vuxna stamceller kan avsevärt bidra till tumör bildning som cellulära ursprunget av cancer i många olika typer av organ inklusive hud vävnader3,4,5. På samma sätt kan vuxna melanocytstamceller (MCSCs) i den murina dorsala huden fungerar som melanom celler av ursprung vid avvikande aktivering av ras/RAF och akt vägar6. Emellertid, dessa onkogena mutationer ensam inte kan effektivt inducera tumör bildning från quiescent MCSCs. Melanocytiska tumörer utvecklas så småningom när MCSCs blir aktiv under naturliga hår cykling. Men i detta protokoll kommer vi att beskriva metoder för att artificiellt inducera cellulär aktivering av tumör-benägen mcscs, vilket underlättar exakt kontroll av melanom initiering6,7.
Genom de metoder som beskrivs här, rumsliga och temporala kontroll av kutan melanom initiering från tumör-benägen MCSCs uttrycker onkogena BRAFV600E tillsammans med förlust av PTEN uttryck kan framgångs rikt utföras, som vi tidigare har rapporterat6. Denna metod innehåller tidigare fynd som visar hår follikeln stamcells aktivering genom avhårning samt hur exponering av murina hud till UV-B kan under lätta aktiveringen av mcscs bosatt i hår säcken och flyttning av denna cellulära subpopulation till interfollicular epidermis6,8,9,10. Dessa in vivo modell system kan ge värdefull information om hur fysiologiska och miljömässiga förändringar kan förändra cellulär status av melanom-benägna MCSCs, vilket i sin tur kan inducera betydande initiering av melanom i huden.
Hallmark genetiska förändringar som ofta finns i kutan melanom tumörer har väl beskrivits13. Den mest dominerande föraren mutation är BRAFV600E, och en genetiskt modifierade mus modell för BRAFV600E-Medierat melanom genererades av Bosenberg grupp14 och deponeras i Jackson Laboratory. Med hjälp av denna mus modell, visade vår senaste studie kravet på cellulär aktivering av tumör-benägen MCSCs för betydande initiering av <…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av kansliet för biträdande sekreterare i försvaret för hälso frågor, genom peer recenserade cancer Research program under tilldelning W81XWH-16-1-0272. Åsikter, tolkningar, satser och rekommendationer är de av författarna och är inte nödvändigt vis godkänts av försvarsdepartementet. Detta arbete stöddes också av ett frö bidrag från Cornell Stem cell program till A.C. White. H. Moon stöddes av Cornell Center for vertebrate genomik Scholar program.
Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
Cotton swabs | various | ||
Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
Isoflurane | various | Veterinary grade | |
Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |