Santral hücreleri ve bitki dokularının mekanik özelliklerini ve Turgor basıncını ölçmek için Atomic Force Microkopi kullanımı
Summary
Burada, hücre ve dokularda nano ve mikro girinti aracı olarak işletilen atomik kuvvet mikroskobu (AFM) sunuyoruz. Cihaz, numunenin 3D yüzey topografisini ve hücre duvarı Young ‘ın modüllerinin yanı sıra Turgor basıncını da içeren mekanik özelliklerini eşzamanlı olarak satın almayı sağlar.
Abstract
Burada atom kuvveti mikroskobu kullanımı bitki dokularına girinti ve mekanik özelliklerini kurtarmak için sunuyoruz. Girintileme modunda iki farklı mikroskopları kullanarak, bir elastik modülün nasıl ölçüleceği ve hücre duvarının mekanik özelliklerini değerlendirmek için nasıl kullanılacağını gösteririz. Buna ek olarak, Turgor basıncını nasıl değerlendireceğiz de açıklanmaktadır. Atomik kuvvet mikroskopinin ana avantajları, non-invaziv, nispeten hızlı (5 ~ 20 dakika) ve yüzeysel olarak düz olan yaşam bitki dokusunun neredeyse her türlü tedaviye gerek kalmadan analiz edilebilir olmasıdır. Çözünürlük, uç boyutuna ve birim alanı başına ölçüm sayısına bağlı olarak çok iyi olabilir. Bu yöntemin bir sınırlama sadece yüzeysel hücre katmanına doğrudan erişim sağlar olmasıdır.
Introduction
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) tarama prob mikroskobu (SPM) ailesine aittir, genellikle birkaç nanometrelerin yarıçapı olan bir uç bir numunenin yüzeyini tarar. Bir yüzeyin tespiti, optik veya elektron bazlı yöntemlerle değil, uç ile örnek yüzey arasındaki etkileşim güçleri aracılığıyla elde edilmez. Böylece, bu teknik örnek bir yüzeyin topografik karakterizasyonu ile sınırlı değildir (birkaç nanometreye kadar gidebilir 3D çözünürlük), aynı zamanda elektrostatik, Van der Waals veya kontak kuvvetleri gibi etkileşim kuvvetlerinin her türlü ölçümünü sağlar. Ayrıca, uç biyolojik bir numunenin yüzeyine kuvvet uygulamak ve ortaya çıkan deformasyonu ölçmek için kullanılabilir, sözde “girinti”, mekanik özelliklerini belirlemek için (örneğin, Young ‘s modulus, viskoelastik özellikleri).
Bitki hücresi duvarlarının mekanik özellikleri, gelişim süreçlerinin temelindeki mekanizmaları anlamaya çalışırken dikkate alınması gerekli olan1,2,3. Nitekim, bu özellikleri sıkıca geliştirme sırasında kontrol edilir, hücre duvar yumuşatıcı hücrelerin büyümesine izin vermek için gerekli olduğundan özellikle. AFM, bu özellikleri ölçmek ve organlar, dokular veya gelişimsel aşamaları arasında değişme şeklini incelemek için kullanılabilir.
Bu yazıda, hem hücre duvarı mekanik özelliklerini hem de Turgor basıncını ölçmek için AFM ‘nin nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bu iki uygulama iki farklı AFM mikroskoplar üzerinde gösterilmiştir ve sonra burada ayrıntılı olarak gösterilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bitkilerin şekillerin ortaya çıkması esas olarak zaman ve uzay sırasında koordine oranı ve büyüme yönü ile belirlenir. Bitki hücreleri, onları bir araya yapıştıran bir polisakkaridik matrisden yapılmış sert bir hücre duvarında kaplı. Sonuç olarak, hücre genişleme hücre duvarı çekerek Turgor basıncı arasındaki denge tarafından kontrol edilir, ve bu basınca dayanıklı hücre duvarının sertlik. Kalkınma temel mekanizmaları anlamak için, farklı dokularda veya belirli bir organ hücrele…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kendi teknik destek için PLıM ekibi teşekkür etmek istiyorum, yanı sıra Arezki Boudaoud ve yararlı tartışmalar için RDP laboratuarında Biophysic ekibinin üyeleri.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
Riferimenti
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
