यांत्रिक गुणों और संयंत्र कोशिकाओं और संयंत्र ऊतकों के Turgor दबाव को मापने के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग
Summary
यहाँ, हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम), कोशिकाओं और ऊतकों पर एक नैनो और सूक्ष्म इंडेंटेशन उपकरण के रूप में संचालित प्रस्तुत करते हैं। साधन नमूना और उसके यांत्रिक गुणों के 3 डी सतह स्थलाकृति के एक साथ अधिग्रहण की अनुमति देता है, सेल दीवार यंग के मापांक के साथ ही turgor दबाव सहित.
Abstract
हम यहाँ परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए इंडेंट संयंत्र के ऊतकों और उसके यांत्रिक गुणों को ठीक प्रस्तुत करते हैं. इंडेंटेशन मोड में दो अलग-अलग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, हम दिखाते हैं कि एक लोचदार मापांक को कैसे मापें और सेल दीवार यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए इसका उपयोग कैसे करें। इसके अलावा, हम यह भी समझा कैसे turgor दबाव का मूल्यांकन करने के लिए. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का मुख्य लाभ यह है कि यह गैर इनवेसिव है, अपेक्षाकृत तेजी से (5 डिग्री 20 मिनट), और है कि लगभग रहने वाले संयंत्र ऊतक है कि सतही फ्लैट के किसी भी प्रकार के उपचार के लिए आवश्यकता के बिना विश्लेषण किया जा सकता है. संकल्प बहुत अच्छा हो सकता है, टिप आकार के आधार पर और प्रति इकाई क्षेत्र माप की संख्या पर. इस विधि की एक सीमा यह है कि यह केवल सतही कोशिका परत के लिए सीधी पहुँच देता है.
Introduction
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) स्कैनिंग जांच माइक्रोस्कोपी (एसपीएम) परिवार से संबंधित है, जहां आमतौर पर कुछ नैनोमीटर की त्रिज्या के साथ एक टिप एक नमूने की सतह को स्कैन करता है। एक सतह का पता लगाने ऑप्टिकल या इलेक्ट्रॉन आधारित तरीकों के माध्यम से प्राप्त नहीं है, लेकिन टिप और नमूना सतह के बीच बातचीत बलों के माध्यम से. इस प्रकार, इस तकनीक के एक नमूना सतह (3 डी संकल्प जो कुछ नैनोमीटर के लिए नीचे जा सकते हैं) के स्थलाकृतिक लक्षण तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी इस तरह के इलेक्ट्रोस्टैटिक, वैन der Waals या संपर्क बलों के रूप में बातचीत बलों के किसी भी प्रकार की माप की अनुमति देता है. इसके अलावा, टिप एक जैविक नमूना की सतह पर बलों को लागू करने और जिसके परिणामस्वरूप विरूपण को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथाकथित “इंडेंटेशन”, आदेश में अपने यांत्रिक गुणों का निर्धारण करने के लिए (उदा, यंग के मापांक, विस्कोलोची गुण).
पादप कोशिका की दीवारों के यांत्रिक गुणों को ध्यान में रखना आवश्यक है जब विकास प्रक्रियाओं के अंतर्निहित तंत्रों को समझने का प्रयास किया जाता है1,2,3. दरअसल, इन गुणों को विकास के दौरान कसकर नियंत्रित किया जाता है, विशेष रूप से क्योंकि कोशिका दीवार नरम कोशिकाओं को बढ़ने की अनुमति देने के लिए आवश्यक है। AFM इन गुणों को मापने और जिस तरह से वे अंगों, ऊतकों या विकासात्मक चरणों के बीच बदलने का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस पत्र में, हम वर्णन कैसे हम AFM का उपयोग करने के लिए दोनों सेल दीवार यांत्रिक गुण और turgor दबाव को मापने. इन दो अनुप्रयोगों के दो अलग AFM माइक्रोस्कोप पर प्रदर्शन कर रहे हैं और यहाँ के बाद विस्तृत हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
पौधों में आकृतियों का उद्भव मुख्य रूप से समय और स्थान के दौरान समन्वित दर और विकास की दिशा द्वारा निर्धारित किया जाता है। पादप कोशिकाओं को पॉलीसैकेर्डिक मैट्रिक्स से बनी एक कठोर कोशिका दीवार में रखा ज…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके तकनीकी सहायता के लिए PLATIM टीम को धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही साथ Arezki Boudaoud और सहायक विचार विमर्श के लिए आरडीपी प्रयोगशाला में Biophysic टीम के सदस्यों.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
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