Levering av antistoffer inn i murine Brain via konveksjon-forbedret levering

Summary

Konveksjon-forbedret levering (CED) er en metode som muliggjør effektiv levering av legemiddel i hjernen ved direkte tilførsel av store vev volumer. Prosedyren krever bruk av katetre og en optimalisert injeksjon prosedyre. Denne protokollen beskriver en metode for CED av et antistoff til en mus hjerne.

Abstract

Konveksjon-forbedret levering (CED) er en nevrokirurgisk teknikk som muliggjør effektiv tilførsel av store hjerne volumer ved hjelp av et kateter system. En slik tilnærming gir en trygg leveringsmetode by-bestått blod hjerne barrieren (BBB), og dermed tillater behandling med legemidler med dårlig BBB-permeabilitet eller de som systemisk eksponering ikke er ønskelig, f. eks på grunn av toksisitet. CED krever optimalisering av kateteret design, injeksjon protokollen, og egenskapene til infusate. Med denne protokollen beskriver vi hvordan du utfører CED av en løsning som inneholder opptil 20 μg av et antistoff i nucleus caudatus putamen av mus. Den beskriver utarbeidelse av trinn katetre, teste dem in vitro og utføre CED i mus ved hjelp av en gradvis injeksjon program. Protokollen kan lett justeres for andre infusjons volumer og kan brukes til sprøytebruk av ulike Bevegelsesuskarphet eller farmakologisk aktive eller inaktive stoffer, inkludert chemotherapeutics, cytokiner, virale partikler og liposomer.

Introduction

Blod hjerne barrieren (BBB) danner en semipermeable grense som skiller det sentrale nervesystemet (CNS) fra blodsirkulasjonen. Å nå CNS med legemiddel selskap er imidlertid nødvendig i sammenheng med ulike sykdommer, som hjernesvulster, Alzheimers sykdom (AD) eller Parkinsons sykdom (PD) blant andre¹. Dette blir viktig i utviklingen av nye terapier, spesielt hvis testet stoffet utstillinger dårlig BBB permeabilitet eller systemisk eksponering kan føre til farlig toksisitet^1,2. Noen av de klinisk brukte Antistoffene viser begge disse funksjonene. En løsning på dette problemet ville være å levere legemiddel selskap direkte bak BBB.

Konveksjon-forbedret levering (CED) er en nevrokirurgisk teknikk som muliggjør effektiv tilførsel av store hjerne volumer. Dette oppnås ved kirurgisk å installere en eller flere katetre i målområdet. Under stoffet søknaden, en trykk gradient dannes ved åpningen av kateteret, som blir drivkraften av infusate dispersjon i vevet^3,4. Det er således varigheten av infusjon og ikke diffusjon koeffisienter som bestemmer spekteret^2,4,5. Dette gir ensartet levering av infusate over en mye større hjerne volum sammenlignet med konvensjonell, diffusjon basert intracerebrale injeksjon metoder^2,6. På samme tid, denne leveransen modalitet har en lavere risiko for vevsskade². Følgelig kan CED muliggjøre sikker og effektiv administrering av konvensjonelle chemotherapeutics for behandling av CNS-svulster, samt levering av immunmodulerende midler eller agonistic og fiendtlige antistoffer i en rekke andre CNS-lidelser^{2 ,7,8,9}. CED er for tiden testet i behandling av Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, samt høyverdig glioma^2,7,8,10,11.

Kateter design og injeksjons regimet er blant de viktigste faktorene som påvirker utfallet av CED ^{10,12,13,14,15,16}. Videre krever det spesifikke fysikalsk egenskaper av infusate, inkludert moderat størrelse på partiklene, en anioniske ladning, og lav vev affinitet ^10,17. Hver av disse parametrene må være potensielt justeres i henhold til histologiske funksjoner i hjernens region skal være målrettet^2,10,17.

Her beskriver vi metodikk for å utføre CED av en antistoff løsning i nucleus caudatus putamen (striatum) av mus. Videre inkluderer protokollen utarbeidelse av trinn katetre i et laboratorium oppsett, teste dem in vitro og utføre CED.

Det er flere kateter design tilgjengelig i litteraturen, ulik av formen på kanyle, materialene som brukes og antall kateter åpninger^{12,15,18,19,20 ,21,22}. Vi bruker et trinn kateter laget av en smeltet silika kapillær stikker 1 mm fra en butt end metall nål. Dette kateter design kan lett produseres i et forskningslaboratorium og reproduserbar gir gode CED resultater når testet in vitro med agarose blokker med fysiske parametre ligner hjernen parenchyma in vivo²³.

Videre implementerer vi en gradvis dose for å levere 5 μL av infusate in vivo. I en slik protokoll økes injeksjons raten fra 0,2 μL/min til maksimalt 0,8 μL/min, og dermed minimerer sjansene for infusate reflux langs kateteret, samt risiko for vevsskade¹⁶. Ved hjelp av denne protokollen har vi administrert mus med opptil 20 mikrogram antistoff i 5 μL av PBS i løpet av 11 min 30 s.

Protokollen kan lett justeres for andre infusjons volumer eller for injisering av andre stoffer, for eksempel chemotherapeutics, cytokiner, virale partikler eller liposomer^{2,10,14,18 ,22}. Ved bruk av infusate med drastisk forskjellige fysikalsk egenskaper sammenlignet med en fosfat bufret saltvann (PBS) eller kunstig spinalvæske (aCSF)-løsning av antistoffer, anbefales ytterligere validerings trinn. For kateteret montering, validering og CED, beskriver vi alle trinn ved hjelp av en stereotactic robot med en drill og injeksjon enhet montert på en vanlig stereotactic ramme. Denne prosedyren kan også utføres med en manuell stereotactic ramme koblet til programmerbare microinfusion pumpe som kan kjøre den beskrevne glass microsyringes.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her har blitt godkjent av den sveitsiske kantonale veterinær kontor under lisensnummer ZH246/15. 1. utarbeidelse av Step katetre Utarbeidelse av en smeltet silica slange for trinn av kateteret Skjær smeltet silica kapillær med indre diameter på 0,1 mm og veggtykkelse på 0,0325 mm slange til en lengde på 30 mm. Undersøk slangen for sprekker og varme polish endene ved hjelp av en microforge for å sikre slange …

Representative Results

Denne protokollen gjør det mulig å klargjøre trinn katetre (figur 1) for bruk i CED-prosedyren i et laboratoriemiljø. For å kontrollere katetre for lekkasje, reflux langs nål kanalen og tilstopping, anbefaler vi å utføre injeksjoner av et fargestoff, f. eks, trypan blå løsning, i en agarose blokk. Figur 3 viser en sky av trypan blå forming etter injeksjon med 1 μL ved 0,5 μL/minutt ved bruk av et CED-kateter (figur 3a)….

Discussion

Konveksjon-forbedret levering, eller trykk-mediert legemiddel infusjon i hjernen, ble først foreslått i begynnelsen av 1990³. Denne tilnærmingen løfter et stort hjerne bind bak blod hjerne barrieren på en kontrollert måte². Men hittil har bare noen kliniske forsøk blitt utført ved hjelp av denne tilnærmingen, delvis fordi CED i et klinisk oppsett har vist seg å være teknisk krevende^24,25. Den siste utvikl…

Materials

10 μL syringe	Hamilton	7635-01
27 G blunt end needle	Hamilton	7762-01
Agarose	Promega	V3121
Atipamezol	Janssen
Bone wax	Braun	1029754
Buprenorphine	Indivior Schweiz AG
Carprofen	Pfizer AG
Dental drill bits, steel, size ISO 009	Hager & Meisinger	1RF009
Ethanol 100%	Reuss-Chemie AG	179-VL03K-/1
Fentanyl	Helvepharm AG
FITC-Dextran, 2000 kDa	Sigma Aldrich	FD2000S
Flumazenil	Labatec Pharma AG
Formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775-500ML
High viscosity cyanoacrylate glue	Migros
Iodine solution	Mundipharma
Medetomidin	Orion Pharma AG
Microforge	Narishige	MF-900
Midazolam	Roche Pharma AG
Ophthalmic ointment	Bausch + Lomb	Vitamin A Blache
PBS	ThermoFischer Scientific	10010023
Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647	Jackson Immuno
Scalpels	Braun	BB518
Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm	Postnova	Z-FSS-100165
Stereotactic frame for mice	Stoelting	51615
Stereotactic robot	Neurostar	Drill and Injection Robot
Succrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
Topical tissue adhesive	Zoetis	GLUture
Trypan blue	ThermoFischer Scientific	15250061
Water	Bichsel	1000004