Micromanipulation af cirkulerende tumor celler til downstream Molekylær analyse og metastatisk potentiel vurdering

Summary

Her præsenterer vi en integreret arbejdsgang for at identificere fænotypiske og molekylære funktioner, der karakteriserer cirkulerende tumorceller (Ctc’er). Vi kombinerer levende immun farvning og robot-micromanipulation af enkelt-og klynge-Ctc’er med enkelt celle-baserede teknikker til downstream analyse og vurdering af metastaser-såning evne.

Abstract

Blodbårne metastaser tegner sig for de fleste kræftrelaterede dødsfald og involverer cirkulerende tumorceller (Ctc’er), der har succes med at etablere nye tumorer på fjerntliggende steder. Ctc’er findes i blodbanen af patienter som enkeltceller (enkelt Ctc’er) eller som flercellede aggregater (CTC-klynger og CTC-hvide blod celle klynger), hvor sidstnævnte udviser en højere metastatisk evne. Ud over optælling er fænotypiske og molekylære analyser overordentlig vigtig for at dissekere CTC-biologi og identificere handlingsrettede sårbarheder. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af en arbejdsgang, der omfatter CTC immunofarvning og micromanipulation, ex vivo kultur for at vurdere proliferativ og overlevelse kapaciteter af individuelle celler, og in vivo metastase-formation assays. Derudover leverer vi en protokol for at opnå afkobling af CTC-klynger i individuelle celler og undersøgelse af heterogenitet inden for klynger. Med disse tilgange, for eksempel, vi præcist kvantificere overlevelse og proliferativ potentiale af enkelt ctc’er og individuelle celler i CTC klynger, hvilket fører os til den observation, at celler i klynger viser bedre overlevelse og spredning i ex sammenlignet med enkelte ctc’er. samlet set tilbyder vores arbejdsgang en platform til at dissekere ctc’s karakteristika på det enkelt celleniveau, der sigter mod at identificere metastaser-relevante veje og en bedre forståelse af CTC-biologi.

Introduction

Den kliniske manifestation af metastaser i fjerne organer repræsenterer den sidste fase af kræft progression og tegner sig for mere end 90% af kræftrelaterede dødsfald¹. Overgangen fra lokaliseret til metastatisk sygdom er en multi-trins proces, ofte medieret af cirkulerende tumorceller (ctc’er)^2,3,4. Disse celler er udgydt fra den primære tumor i blodcirkulationen og transporteres til fjerne organer, hvor de kan ekstravasere og etablere metastatiske læsioner^5,6. Selv om solide tumorer kan frigive et relativt højt antal Ctc’er, er de fleste Ctc’er bestemt til at dø, på grund af høje forskydningskræfter i omløb, anoikis-medieret celledød, immun angreb eller begrænsede kapaciteter til at tilpasse sig et udenlandsk mikromiljø⁷. Derfor er det afgørende at etablere værktøjer, der muliggør dissektion af de molekylære træk ved de Ctc’er, der er udstyret med metastaser-såning evne. Nylige prækliniske og kliniske undersøgelser tyder på, at tilstedeværelsen og mængden af enkelt ctc’er og CTC-klynger er forbundet med et dårligere resultat hos patienter med forskellige typer af solide tumorer^{8,9,10 , 11} af ^{, 12} ud af ^{, 13} ud af ^{, 14} ud af . CTC-klynger er grupper af to eller flere ctc’er, der er knyttet til hinanden under cirkulation og er mere effektive i dannelsen af metastaser sammenlignet med enkelt ctcs^3,15,16. Celler i en klynge opretholder stærk celle-celle vedhæftning gennem desmosomer og klæber vejkryds, som kan bidrage til at overvinde anoikis^17,18. For nylig bemærkede vi, at klyngedannelse af Ctc’er er knyttet til hypomethylering af bindingssteder for stemthed-og proliferation-associerede transkription faktorer, hvilket fører til en øget evne til at initiere metastase¹⁹. CTC klynge afkobling resulterer i remodeling af centrale bindingssteder, og dermed undertrykkelse af deres metastatisk potentiale¹⁹. Desuden til klynger af kræftceller, Ctc’er kan også associere til hvide blodlegemer (hyppigst neutrofiler) at opretholde høje proliferation niveauer i omløb og øge deres metastatisk kapacitet²⁰. Imidlertid er CTCs ‘ biologi kun delvist forstået, og flere spørgsmål forbliver åbne, herunder de underliggende molekylære funktioner og sårbarheder i enkelt-og klynge celler.

I de seneste år er der blevet etableret flere strategier, som udnytter celleoverflade udtryks mønstre samt ctc’er ‘ fysiske egenskaber til deres isolation^{21,22,23,24, 25}. antigen-afhængige isolations metoder stole mest på udtrykket af celleoverfladen epithelial celle vedhæftning molekyle (epcam)²⁶. Den hyppigst anvendte og (i øjeblikket) den eneste FDA-godkendte platform for CTC-optælling, er CellSearch-systemet, som er baseret på en totrinsprocedure for at isolere CTCs²¹. I det første trin fjernes plasma komponenterne ved centrifugering, mens Ctc’er optages med magnetiske ferrovæsker, der er koblet til anti-EpCAM-antistoffer. I det andet trin er den CTC-berigede opløsning plettet for nukleerede (dapi-positive) celler, der udtrykker cytokeratin (CK)^8,18,19, mens hvide blodlegemer (WBCs) identificeres ved hjælp af Pan-leukocyt markør CD45. Endelig er indfangede celler placeret på en integreret screening platform og Ctc’er identificeres gennem udtrykket af EpCAM, CKs, og DAPI samtidig være negativ for CD45. Selvom dette anses for at være guldstandarden for CTC-optælling, er downstream-Molekylær analyse udfordrende med denne teknologi på grund af iboende begrænsninger i CTC-hentning. Desuden, i betragtning af sin isolation procedure, cellsearch kan favorisere berigelse af ctc’er med højere epcam niveauer i forhold til ctc’er med lavere epcam udtryk, skyldes for eksempel kræft heterogenitet²⁷ eller downregulation af epitel markører ^28,29. For at overvinde disse begrænsninger er der opstået antigen-uafhængige teknologier til berigelse af Ctc’er. For eksempel integrerer CTC-iChip Hydrodynamisk adskillelse af nukleerede celler, herunder Ctc’er og Wbc’er fra de resterende blodkomponenter, efterfulgt af en immunomagnetisk nedbrydning af antistof-mærkede Wbc’er, der muliggør rensning af ukodede og levedygtige Ctc’er i opløsning²⁵. Desuden har det forhold, at de fleste ctc’er er lidt større end røde blodlegemer (RBC’er) eller WBCs, ført til udvikling af størrelses baserede CTC-berignings teknologier^23,30 (f. eks. parsortix-systemet (Angle)), som gør brug af en mikrofluidic-baseret teknologi, der omfatter en indsnævring kanal på tværs af separations kassetten, førende celler til en Terminal hul på enten 10, 8, 6,5 eller 4,5 μm (forskellige størrelser er tilgængelige afhængigt af den forventede diameter af Target cancerceller). De fleste af blodcellerne passerer gennem den smalle kløft, mens Ctc’er bliver fanget på grund af deres størrelse (men også på grund af deres lavere deformabilitet) og er derfor bevaret i kassetten. Revertering af strømningsretningen muliggør frigivelse af indfangede Ctc’er, som er i en levedygtig tilstand og egner sig til downstream-analyse. Uafhængigt af den valgte protokol til CTC-isolation giver typiske procedurer efter berigelse dog stadig Ctc’er, der blandes med et relativt lille antal RBC’er og Wbc’er, hvilket gør analysen af rene enkelt-eller bulk-Ctc’er udfordrende. For at løse dette problem, vi etableret en arbejdsproces, der tillader CTC manipulation uden potentiel bias introduceret af blodlegemer kontaminanter. Tilføjelsen af immun farvning på forhånd, med variable antistof kombinationer, adskiller Ctc’er fra blodlegemer og gør det endda muligt at identificere CTC-undergrupper med særskilte overflade-markør udtryks profiler. Denne meget tilpasselig procedure kan derefter yderligere kombineres med specifikke downstream applikationer.

Her beskriver vi en arbejdsproces, der starter fra et CTC-beriget produkt (opnået med en hvilken som helst CTC-berigelses teknologi) og kombinerer flere tilgange for at få indsigt i CTC-biologi ved enkelt celle opløsning. I en nøddeskal, vores workflow gør det muligt at identificere enkelt ctc’er, CTC klynger og CTC-WBC klynger ved levende immun farvning, efterfulgt af en enkelt celle micromanipulation og downstream analyse ved hjælp af ex vivo dyrkning protokoller, enkelt celle sekvensering og in vivo -metastase-assays.

Protocol

Alle procedurer, der involverer blodprøver fra patienter, blev udført ved underskrevet informeret samtykke fra deltagerne. Procedurer blev kørt i henhold til protokoller EKNZ BASEC 2016-00067 og EK 321/10, godkendt af den etiske og institutionelle Review bestyrelse (etisk komité nordvest/centrale Schweiz [EKNZ]), og i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen. Alle procedurer vedrørende dyr blev udført i overensstemmelse med de institutionelle og kantonale retningslinjer (godkendt mu…

Representative Results

Det præsenterede workflow gør det muligt at forberede individuelle Ctc’er, enten fra enkeltstående Ctc’er eller adskilt fra CTC-klynger. Ctc’er fra patienter eller tumor-bærende mus er beriget med fuldblod med tilgængelige CTC-berigelses metoder og derefter plettet med antistoffer mod cancer-associerede markører (f. eks. EpCAM, grøn) og WBC-specifikke markører (f. eks. CD45, rød) (figur 1a ). Det farvede CTC-produkt overføres derefter til micromanip…

Discussion

Den molekylære karakterisering af Ctc’er holder løftet om at forbedre vores forståelse af den metastatiske proces og guide udviklingen af nye anti-metastaser behandlinger. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af de protokoller, der muliggør CTC micromanipulation og downstream analyse, herunder både enkelt celle-baserede funktionelle assays, genekspression analyse og in vivo transplantation for metastatisk potentiale vurdering²⁰.

Blandt de mest kritiske t…

Materials

Anti-human EpCAM-AF488	Cell Signaling Technology	CST5198	clone: VU1D9
1X DPBS	Invitrogen	14190169	no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate	Corning	3471
Anti-human CD45-BV605	Biolegend	304041	clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC	GeneTex	GTX11400	clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488	Biolegend	324410	clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605	Biolegend	103139	clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA	BD	366643	for human blood collection
Cell Celector	ALS	CC1001	core unit
CellD software	ALS		version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA	Sarstedt	41.3395.005	for mouse blood collection
PCR tubes	Corning	PCR-02-L-C
RLT Plus	Quiagen	1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor	Thermo Fisher	AM2696	1 U/µL