下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション
Summary
ここでは、循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付ける表現型および分子的特徴を同定するための統合ワークフローを紹介する。単一およびクラスタ化された CTCs の生免疫染色とロボットマイクロマニピュレーションを、下流解析および転移播種能力の評価のための単一細胞ベースの技術と組み合わせています。
Abstract
血液によって媒介される転移は、ほとんどの癌に関連した死亡と、遠隔地での新しい腫瘍の確立に成功している循環腫瘍細胞 (CTCs) を含む。CTCs は、単一細胞 (単一 CTCs) または多細胞集合体 (CTC クラスターおよび CTC-白血球クラスター) として患者の血流に見られ、後者はより高い転移性能力を示す。列挙型を超えて、表現型および分子分析は CTC 生物学を分析し、実用的な脆弱性を識別するために非常に重要です。ここでは、CTC 免疫染色およびマイクロマニピュレーションを含むワークフローの詳細な説明を提供し、 ex インビボ培養は、個々の細胞の増殖および生存能力を評価し、インビボ転移形成アッセイを行う。また、CTC クラスタを個々の細胞に解離させ、クラスタ内の異質性を調べるためのプロトコルも提供しています。これらのアプローチによって、例えば、CTC クラスター内の単一の CTCs と個々の細胞の生存と増殖の可能性を正確に定量化し、クラスター内の細胞が ex においてより良い生存と増殖を表示するという観察に導いた。 インビボ培養は単一 CTCs と比較した。全体として、単一細胞レベルで CTCs の特性を分析するためのプラットフォームを提供し、転移関連経路の同定と CTC 生物学のより良い理解を目指します。
Introduction
遠隔臓器における転移の臨床的発現は、癌進行の最終段階を表し、癌関連死の 90% 以上を占める。局在化から転移性疾患への移行は多段階プロセスであり、しばしば循環腫瘍細胞 (CTCs)2、3、4によって媒介される。これらの細胞は、原発腫瘍から血液循環に流され、遠くの器官に運ばれ、そこで転移性病変5,6を extravasate ことができる。固形腫瘍は比較的高い数の CTCs を放出することができるが、ほとんどの CTCs は死ぬ運命にあり、循環における高い剪断力、アノイキス媒介性細胞死、免疫攻撃、または外来微小環境7に適応する能力が限られている。したがって、転移播種能力を持つ CTCs の分子特性を解剖するためのツールを確立することが重要です。最近の前臨床および臨床研究は、単一の CTCs および CTC クラスターの存在および量が、様々なタイプの固形腫瘍の患者におけるより悪い結果と関連していることを示唆する8,9,10,11,12,13,14.CTC クラスタは循環の間に互いに付す2つ以上の CTCs のグループで、単一 CTCs3、15、16と比較される転移を形成することでより有効である。クラスタ内の細胞は、デスモゾームおよび adherens 接合を介して強力な細胞細胞接着を維持し、アノイキス17,18を克服するのに役立つ可能性がある。最近、我々は、CTCs のクラスタリングが stemness および増殖関連転写因子の結合部位の hypomethylation にリンクされていることを観察し、転移19を首尾よく開始する能力を高めることにつながる。CTC クラスタ解離は、キー結合部位のリモデリングをもたらし、そして結果的に、それらの転移性電位19の抑制をもたらす。癌細胞のクラスターに加えて、CTCs は、白血球 (最も頻繁に好中球) に関連付けて循環中の高い増殖レベルを維持し、その転移性能力20を増加させることもできる。しかし、CTCs の生物学は部分的にしか理解されておらないし、単一およびクラスター化された細胞の根底にある分子的特徴と脆弱性を含め、いくつかの質問は開いたままである。
近年では、細胞表面発現パターンだけでなく、それらの分離のための CTCs の物理的特性を利用するいくつかの戦略が確立されています21,22,23,24,25. 抗原依存性分離法は、細胞表面上皮細胞接着分子 (EpCAM)26の発現に主に依存している。CTC 列挙のために最も頻繁に使用され、(現時点では) 唯一の FDA 承認プラットフォームは、CTCs21を分離するための2段階の手順に基づいている CellSearch システムです。最初のステップでは、血漿成分は遠心分離によって除去され、一方、CTCs は抗 EpCAM 抗体に結合した磁気 ferrofluids で捕捉される。第2工程において、CTC 富化溶液は、サイトケラチン (CK)8、18、19を発現する有核 (DAPI −陽性) 細胞について染色され、一方白血球 (WBCs) は、パン-白血球マーカー CD45.最後に、捕捉した細胞は、統合スクリーニングプラットフォーム上に配置され、CD45 については陰性である一方、CTCs は EpCAM、中正、および DAPI の発現を介して同定される。これは CTC 列挙のための金本位と考えられていますが、CTC 検索に内在する制約により、下流の分子分析はこの技術では困難です。さらに、その分離手順を考えると、CellSearch は、癌の不均一性27または上皮マーカーの下方制御に例えば、より低い epcam 発現を有する CTCs と比較して、より高い Epcam レベルの CTCs の濃縮を支持することができる28、29。これらの制限を克服するために、CTCs の富化のための抗原非依存性技術が出現してきた。例えば、iChip は、残りの血液成分からの CTCs および WBCs を含む有核細胞の流体力学的分離を統合し、続いて抗体タグ付き WBCs の immunomagnetic 枯渇により、タグなしおよび生存可能な CTCs の精製ができる。解決策25.さらに、ほとんどの CTCs が赤血球 (赤血球) や WBCs よりもわずかに大きいという事実は、サイズベースの CTC 濃縮技術23,30 (例えば、Parsortix システム (ANGLE)) を利用するマイクロ流体ベースの技術は、分離カセットを横切って狭窄チャネルを含む、10、8、6.5 または4.5 μ m のいずれかの末端間隙に細胞をリードする (異なるサイズは、標的癌細胞の予想される直径に応じて利用可能である)。血液細胞のほとんどは狭い隙間を通過し、一方、CTCs はそのサイズのために閉じ込められます (しかし、その低い変形性のためにも)、したがって、カセットに保持される。流れの方向を戻すことは捕獲された CTCs の解放を可能にし、下流の分析のために適している。しかし、CTC 分離のために選択されたプロトコルとは関係なく、典型的なポストエンリッチメント手順は、比較的少数の赤血球および WBCs と混合される CTCs を生成し、純粋な単一またはバルク CTCs の分析を困難にします。この問題に対処するために、我々は、血球汚染物質によって生じる潜在的なバイアスなしに CTC 操作を可能にするワークフローを確立した。事前に免疫染色を追加することで、可変抗体の組み合わせにより、CTCs を血液細胞から区別し、さらには異なる表面マーカー発現プロファイルを有する CTC サブグループを同定することができます。この高度にカスタマイズ可能な手順は、さらに特定のダウンストリームアプリケーションと組み合わせることができます。
ここでは、ctc が濃縮された製品 (任意の CTC エンリッチメント技術で得られる) から開始するワークフローについて説明し、1つのセルの分解能で CTC の生物学に関する洞察を得るためのいくつかのアプローチを組み合わせています。一言で言えば、私達のワークフローは生きて免疫染色によって単一の CTCs、CTC のクラスターおよび CTC-WBC のクラスターの識別を可能にし、前のインビボ培養プロトコルを使用して単一細胞のマイクロマニピュレーションおよび下流の分析に続いて、単一細胞配列決定、およびインビボ転移アッセイを行う。
Protocol
Representative Results
Discussion
CTCs の分子的キャラクタリゼーションは、転移性プロセスに対する我々の理解を改善し、新しい抗転移療法の開発を導くという約束を保持している。ここでは、CTC マイクロマニピュレーションおよび下流解析を可能にするこれらのプロトコルの詳細な説明を提供し、単一細胞ベースの機能アッセイ、遺伝子発現分析、および転移性電位に対するインビボ移植を含む評価20</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私達は私達の研究のために血を寄付したすべての患者、またすべての関係の臨床医および研究の看護婦に感謝する。イェンス Eberhardt、Uwe コク birke、および ALS 自動化ラボソリューション GmbH からのカタリーナ Uhlig に感謝し、継続的なサポートを行っています。私たちは、フィードバックと議論のためにアセトラボのすべてのメンバーに感謝します。アセトラボでの研究は、欧州研究評議会、欧州連合、スイス国立科学財団、スイス癌連盟、バーゼル癌連盟、バーゼルの2州のチューリッヒを介して、バーゼル大学によってサポートされています。
Materials
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
Riferimenti
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