하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

Summary

여기서, 우리는 순환 종양 세포 (CTCs)를 특성화 하는 표현 형 및 분자 특징을 식별 하는 통합 워크플로우를 제시 합니다. 당사는 단일 및 클러스터형 CTCs의 살아있는 면역 염색 및 로봇 미세 조작을 단일 세포 기반 기술로 결합 하 여 전이 시드 능력의 다운스트림 분석과 평가를 제공 합니다.

Abstract

혈액 매개 전이 대부분의 암 관련 죽음에 대 한 계정 및 순환 종양 세포를 포함 (CTCs) 먼 사이트에서 새로운 종양을 확립에 성공 하는. CTCs는 환자 들의 혈 류에서 단일 세포 (단일 CTCs)로 또는 멀티 세포 집합체 (CTC 클러스터와 CTC 백혈구 군집)로 서, 후자는 더 높은 전이성 능력을 표시 합니다. 열거를 넘어서, 표현 형 및 분자 분석은 CTC 생물학을 분해 하 고 실행 가능한 취약점을 식별 하는 것이 매우 중요 합니다. 여기서, 우리는 CTC 면역 염색 및 미세 조작, 개별 세포의 증식 및 생존 능력을 평가 하기 위한 생체 내 배양, 및 생체 내 전이 형성 분석을 포함 하는 워크플로우에 대 한 상세한 설명을 제공 한다. 또한 CTC 클러스터를 개별 셀로 해리 하 고 군집 내 이질성을 조사 하는 프로토콜을 제공 합니다. 예를 들어, 이러한 접근법을 통해 우리는 CTC 클러스터 내에서 단일 CTCs 및 개별 세포의 생존과 증식 가능성을 정확 하 게 정량화 하 여 클러스터 내의 세포가 ex에서 더 나은 생존과 증식을 표시 한다는 관찰을 이끌어 냅니다. 생체 배양은 단일 ctcs에 비해. 전반적으로, 우리의 작업 흐름은 전이 관련 경로의 식별과 CTC 생물학의 더 나은 이해를 목표로, 단일 세포 수준에서 CTCs의 특성을 분해 하는 플랫폼을 제공 합니다.

Introduction

먼 장기에서의 전이의 임상 징후는 암 진행의 최종 단계를 나타내며 암 관련 사망자의 90% 이상을 차지 합니다. 국 소화 된 전이성 질환에서의 전환은 종종 순환 종양 세포 (ctcs)^2,4에 의해 매개 되는 다단계 과정 이다. 이 세포는 1 차적인 종양에서 혈액 순환을 안으로 흘리 고 먼 기관으로 수송 됩니다, 어디 그들은 배설 하 고 전이성 병 변^5,6를 수립할 수 있습니다. 고 형 종양이 CTCs의 상대적으로 높은 수를 방출 할 수 있더라도, 대부분의 CTCs는 순환에 있는 높은 전단 력, anoikis 매개 세포 사 멸, 면역 공격 또는 외국 미세 환경에 적응 하는 제한 된 기능 때문에 죽을 운명입니다⁷. 따라서 전이 파 종 능력을 부여 받은 CTCs의 분자 특징에 대 한 해 부를 가능 하 게 하는 도구를 확립 하는 것이 중추적인 역할을 합니다. 최근의 전 임상 및 임상 연구는 단일 ctcs 및 CTC 클러스터의 존재 및 양이 다양 한 종류의 고 형 종양을 가진 환자에서 더 나쁜 결과와 연관 되어 있음을 시사 한다^{8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14} . CTC 클러스터는 순환 중에 서로 연결 된 2 개 이상의 ctcs의 그룹으로 서, 단일 ctcs^3,15,16에 비하여 전이 형성에 보다 효율적 이다. 클러스터 내의 세포는 아 노 ikis^17,18을 극복 하는 데 도움이 될 수 있는 desmosomes 및 피 착 체 접합을 통해 강력한 세포 세포 부착을 유지 합니다. 최근에, CTCs의 군집은 형태소-및 증식 관련 전사 인자에 대 한 결합 사이트의 저 메 틸 화에 연결 되어, 전이¹⁹를 성공적으로 개시 하는 증가 된 능력으로 이어지는 것을 관찰 하였다. CTC 군집 해리는 키 결합 부위를 리 모델링 하 고, 결과적으로 그들의 전이성 전위의 억제를 초래 한다 (¹⁹). 암 세포의 클러스터에 추가적으로, CTCs는 또한 백혈구 (가장 빈번 하 게 호 중구)에 연결 하 여 순환의 높은 증식 수준을 유지 하 고 전이성 능력²⁰을 증가 시킬 수 있습니다. 그러나 CTCs의 생물학은 부분적 으로만 이해 되며 단일 및 클러스터 된 세포의 기본 분자 특징 및 취약점을 포함 하 여 여러 가지 질문이 열려 있습니다.

최근 몇 년 동안, 세포 표면 발현 패턴을 악용 하는 여러 가지 전략 들이 확립 되 고 그들의 격리를 위한 ctcs의 물리적 성질 들도,²²,²³,^{24 25}. 항 원 의존성 분리 방법은 세포 표면 상피 세포 부착 분자 (epcam)²⁶의 발현에 주로 의존 한다. 가장 자주 사용 되는 (현재) CTC 열거를 위한 유일한 FDA 승인 플랫폼은 CTCs²¹을 분리 하는 2 단계 절차를 기반으로 하는 cellsearch 시스템입니다. 첫 번째 단계에서, 혈장 성분은 원심 분리에 의해 제거 되 고, CTCs는 항 EpCAM 항 체에 결합 된 자성 강 유전으로 포착 됩니다. 상기 제 2 단계에서, 상기 CTC 농축 용액은 백혈구 케 라틴을 발현 하는 핵 (dapi 양성) 세포를 염색 하여 적혈구 (wbc)를 사용 하 여 식별 되는 동안 범 백혈구 마커 CD45. 마지막으로 캡처된 셀은 통합 스크리닝 플랫폼에 배치 되 고 CTCs는 EpCAM, CKs 및 DAPI의 표현식을 통해 CD45에 대해 부정적으로 식별 됩니다. 이는 CTC 열거에 대 한 금 표준으로 간주 되지만, 하류 분자 분석은 CTC 회수에 내재 된 제약으로 인해이 기술에 도전 한다. 또한, 분리 절차를 고려할 때, CellSearch는 암 이질성 (²⁷ ) 또는 상피 마커의 ^{하향 조절 때문에 더 낮은 epcam 발현을 갖는 ctcs 보다 높은 Epcam 수준으로 ctcs의 농축을 선호 할 수 있습니다. 28,29}. 이러한 한계를 극복 하기 위해 CTCs의 농축을 위한 항 원 독립적인 기술이 등장 했습니다. 예를 들어, CTC-iChip는 잔류 혈액 성분 으로부터의 CTCs 및 백혈구를 포함 한 핵 세포의 유체역학 적 분리를 통합 하 고, 항 체 태그 immunomagnetic 고갈에 이어서, 태그 없는 및 실행 가능한 CTCs의 정제를 허용 합니다. 솔루션²⁵. 추가적으로, 대부분의 ctcs는 적혈구 (rbcs) 또는 wbc 보다 약간 더 큰 것은 크기 기반 CTC 보강 기술 (예를 들어,³⁰ )의 개발로 이어졌다 (예컨대, parsortix 시스템 (ANGLE) 미세 유체 기반 기술은, 분리 카세트에 걸친 협 착 채널을 포함 하 고, 10, 8, 6.5 또는 4.5 µm의 말단 갭을 선도 하는 세포 (상이한 크기는 타겟 암 세포의 예상 직경에 따라 이용 가능 하다). 혈액 세포의 대부분은 좁은 간격을 통과 하 고, CTCs는 그들의 크기 때문에 (그러나 또한 그들의 낮은 변형 성 때문에) 포획 되 고, 그러므로, 카세트에서 유지 됩니다. 흐름 방향을 되돌리면 실행 가능한 상태에 있으며 다운스트림 분석에 적합 한 캡처된 CTCs를 릴리스할 수 있습니다. 그러나 CTC 격리에 대해 선택 된 프로토콜과는 별개로, 일반적인 사후 보강 절차는 비교적 적은 수의 RBCs 및 Wbc와 혼합 된 CTCs를 생성 하 여 순수한 단일 또는 벌크 CTCs의 분석을 어렵게 합니다. 이 문제를 해결 하기 위해, 우리는 혈액 세포 오염 물질에 의해 도입 잠재적인 편견 없이 CTC 조작을 허용 하는 워크 플로우를 설립 했다. 다양 한 항 체 조합으로 면역 염색을 미리 첨가 하면 CTCs를 혈액 세포와 구별 하 고, 고유한 표면 마커 발현 프로필이 있는 CTC 하위 그룹을 식별할 수 있습니다. 이 고도로 사용자 정의 절차는 특정 다운스트림 응용 프로그램과 추가로 결합 될 수 있습니다.

여기에서 우리는 ctc 농축 제품 (선택의 CTC 보강 기술로 얻은)에서 시작 하 고 단일 셀 해상도에서 CTC 생물학에 대 한 통찰력을 얻기 위해 여러 접근법을 결합 하는 워크 플로우를 설명 합니다. 간단히 말해서, 우리의 작업 흐름은 살아있는 면역 염색에 의해 단일 CTCs, CTC 클러스터 및 CTC-WBC 클러스터의 식별을 가능 하 게 하 고, 단일 세포 미세 조작 및 전 생체 배양 프로토콜을 사용한 하류 분석, 단일 세포 시퀀싱 및 생체 내 전이 분석 법.

Protocol

환자의 혈액 샘플과 관련 된 모든 절차는 참가자의 서명 된 정보에의 한 동의 시 수행 되었습니다. 윤리 및 제도적 검토 위원회가 승인한 EKNZ BASEC 2016-00067 및 EK 321/10에 따라 절차를 실행 하 고, 헬싱키의 선언을 준수 하 여 윤리 위원회를 운영 하 고 있습니다. 동물에 관한 모든 절차는 기관 및 캔 토 날 가이드라인 (승인 된 마우스 프로토콜 #2781, 바젤 시의 토 널 수의학 사무실)…

Representative Results

제시 된 워크플로를 통해 단일 CTCs 또는 CTC 클러스터에서 분리 된 개별 CTCs를 준비할 수 있습니다. 환자 또는 종양-베어링 쥐의 CTCs는 전 혈에서 사용 가능한 CTC 농축 방법으로 풍부 하며 암 관련 마커 (예: EpCAM, 녹색) 및 WBC 특이 적 마커 (예: CD45, 적색)에 대 한 항 체로 염색 됩니다 (그림 1a ). 염색 된 CTC 생성물이 미세 조작 스테이션으로 이송 된 후에 ?…

Discussion

CTCs의 분자 특성화는 전이성 프로세스에 대 한 이해를 향상 시키고 새로운 항 전이 요법의 개발을 안내 하는 약속을 유지 합니다. 여기에서 우리는 단일 세포 기반 기능 분석, 유전자 발현 분석 및 전이성 전위에 대 한 생체 내 이식 모두를 포함 하 여 CTC 미세 조작 및 다운스트림 분석이 가능 하도록 하는 프로토콜에 대 한 상세한 설명을 제공 합니다. 평가²⁰.

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Materials

Anti-human EpCAM-AF488	Cell Signaling Technology	CST5198	clone: VU1D9
1X DPBS	Invitrogen	14190169	no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate	Corning	3471
Anti-human CD45-BV605	Biolegend	304041	clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC	GeneTex	GTX11400	clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488	Biolegend	324410	clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605	Biolegend	103139	clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA	BD	366643	for human blood collection
Cell Celector	ALS	CC1001	core unit
CellD software	ALS		version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA	Sarstedt	41.3395.005	for mouse blood collection
PCR tubes	Corning	PCR-02-L-C
RLT Plus	Quiagen	1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor	Thermo Fisher	AM2696	1 U/µL