Mikromanipulering av sirkulerende tumor celler for nedstrøms molekylær analyse og metastatisk potensiell vurdering

Summary

Her presenterer vi en integrert arbeidsflyt for å identifisere fenotypiske og molekylære funksjoner som karakteriserer sirkulerende tumorceller (CTC). Vi kombinerer Live immunostaining og Robotic mikromanipulering av singel og gruppert CTC med én celle-baserte teknikker for nedstrøms analyse og vurdering av metastasering-seeding evne.

Abstract

Blood-borne metastasering står for de fleste kreft-relaterte dødsfall og innebærer sirkulerende tumorceller (CTC) som lykkes i å etablere nye svulster på fjerne steder. CTC er funnet i blodet av pasienter som enkeltceller (enkelt CTC) eller som flercellede aggregater (CTC klynger og CTC-hvite blodlegemer klynger), med sistnevnte viser en høyere metastatisk evne. Utover opplisting, fenotypiske og molekylær analyse er usedvanlig viktig å analysere CTC biologi og å identifisere praktiske sårbarheter. Her gir vi en detaljert beskrivelse av en arbeidsflyt som inkluderer CTC-immunostaining og mikromanipulering, ex vivo -kultur for å vurdere proliferativ-og overlevelses muligheter for enkeltceller, og in vivo metastasering-formasjon. I tillegg gir vi en protokoll for å oppnå dissosiasjon av CTC-klynger i individuelle celler og etterforskningen av intra-Cluster heterogenitet. Med disse tilnærmingene, for eksempel, vi nøyaktig kvantifisere overlevelse og proliferativ potensialet i enkelt CTC og individuelle celler innen CTC-klynger, som fører oss til observasjon at cellene i klynger vise bedre overlevelse og spredning i ex vivo kulturer sammenlignet med enslige CTC. total, vår arbeidsflyt tilbyr en plattform for å analysere egenskapene til CTC på enkelt cellenivå, satsing mot identifisering av metastasering-relevante trasé og en bedre forståelse av CTC biologi.

Introduction

Den kliniske manifestasjon av metastasering i fjerne organer representerer den siste fasen av kreft progresjon og står for mer enn 90% av kreft-relaterte dødsfall¹. Overgangen fra lokaliserte til metastatisk sykdom er en multi-trinns prosess, ofte formidlet av sirkulerende tumorceller (CTC)^2,3,4. Disse cellene er utgytt fra den primære svulst i blodsirkulasjonen og transporteres til fjerntliggende organer, hvor de kan extravasate og etablere metastatisk lesjoner^5,6. Selv om solide svulster kan frigi et relativt høyt antall CTC, de fleste CTC er skjebnebestemt til å dø, på grunn av høye skjærkrefter i omløp, anoikis-mediert celle død, immun angrep eller begrensede evner til å tilpasse seg en utenlandsk mikromiljøet⁷. Derfor er det avgjørende å etablere verktøy som gjør det mulig for Disseksjon av de molekylære funksjonene til de CTC som er utstyrt med metastasering-seeding evne. Nyere prekliniske og kliniske studier tyder på at tilstedeværelsen og mengden av enkelt CTC og CTC klynger er forbundet med et dårligere utfall hos pasienter med ulike typer solide svulster^{8,9,10 , 11} flere ^{, 12} flere ^{, 13} på alle ^{, 14} priser og priser . CTC-klynger er grupper på to eller flere CTC knyttet til hverandre under sirkulasjon og er mer effektive i forming metastasering sammenlignet med én CTC^3,15,16. Celler i en klynge opprettholder en sterk celle vedheft gjennom desmosomes og adherens veikryss, som kan bidra til å overkomme anoikis^17,18. Nylig observerte vi at Clustering av CTC er knyttet til hypometylering av bindende områder for stemness-og spredning-assosiert transkripsjon faktorer, fører til en økt evne til å lykkes initiere metastasering¹⁹. CTC-klynge dissosiasjon resulterer i ombygging av nøkkel bindings steder, og følgelig undertrykkelse av deres metastatisk potensial¹⁹. I tillegg til klynger av kreftceller, CTC kan også knyttes til hvite blodlegemer (oftest nøytrofile) for å opprettholde høy spredning nivåer i omløp og øke sin metastatisk evne²⁰. Men biologi av CTC forstås bare delvis og flere spørsmål forblir åpne, inkludert de underliggende molekylære funksjoner og sårbarheter av enkelt og gruppert celler.

I de senere årene har flere strategier er fastslått at utnytte Cell-overflaten uttrykk mønstre samt fysiske egenskaper CTC for deres isolasjon^{21,22,23,24, 25}. antigen-avhengige isolasjons metoder stole hovedsakelig på uttrykk for celleoverflaten epitel Cell vedheft molekyl (EpCAM)²⁶. Den mest brukte og (i dag) den eneste FDA-godkjente plattformen for CTC-opplisting, er CellSearch-systemet, som er basert på en to-trinns prosedyre for å isolere CTC²¹. I det første trinnet, er plasma komponenter fjernet av sentrifugering, mens CTC er fanget med magnetisk ferrofluids koplet til anti-EpCAM antistoffer. I det andre trinnet er CTC-beriket løsning beiset for kjerne (DAPI-positive) celler uttrykker cytokeratin (ck)^8,18,19, mens hvite blodlegemer (WBCs) identifiseres ved hjelp av Pan-leukocytter markør CD45. Endelig er fanget celler plassert på en integrert screening plattform og CTC er identifisert gjennom uttrykk for EpCAM, CKs og DAPI samtidig som negative for CD45. Selv om dette anses å være gullstandarden for CTC-opplisting, er nedstrøms molekyl analyse utfordrende med denne teknologien på grunn av iboende begrensninger i CTC-henting. I tillegg gitt sin isolasjon prosedyre, CellSearch mai favorisere berikelse av CTC med høyere EpCAM nivåer i forhold til CTC med lavere EpCAM uttrykk, skyldes for eksempel til kreft heterogenitet²⁷ eller downregulation av epitel markører ^28,29. For å overvinne disse begrensningene, har antigen-uavhengige teknologier for berikelse av CTC dukket opp. For eksempel integrerer CTC-iChip hydrodynamisk separasjon av kjerne celler, inkludert CTC og WBCs fra gjenværende blodkomponenter, etterfulgt av en immunomagnetisk Innfanging forringelse av antistoff-merket WBCs, slik at rensing av umerkede og levedyktige CTC i løsning²⁵. I tillegg er det faktum at de fleste CTC er litt større enn røde blodlegemer (RBC) eller WBCs førte til utvikling av størrelse-baserte CTC berikelse teknologier^23,30 (f. eks Parsortix system (vinkel)) som gjør bruk av en mikrovæskebasert-basert teknologi, bestående av en innsnevring kanal på tvers av separasjon kassetten, ledende celler til en Terminal gap på enten 10, 8, 6,5 eller 4,5 μm (forskjellige størrelser er tilgjengelige avhengig av forventet diameter på målet kreftceller). De fleste av blodcellene passerer gjennom det smale gapet, mens CTC blir fanget på grunn av deres størrelse (men også på grunn av deres lavere fleksibilitet) og er derfor beholdt i kassetten. Hvis du tilbakestiller flytretningen, kan du frigi fanget CTC, som er i en levedyktig tilstand og egner seg for nedstrøms analyse. Uavhengig av den valgte protokollen for CTC-isolasjon, men typisk post-berikelse prosedyrer fortsatt gi CTC som er blandet med et relativt lite antall RBC og WBCs, noe som gjør analysen av ren enkelt eller bulk CTC utfordrende. For å løse dette problemet, etablerte vi en arbeidsflyt som gjør at CTC manipulasjon uten potensiell skjevhet innført av blodlegemer forurensninger. Tilsetning av immunostaining på forhånd, med variable antistoff kombinasjoner, skiller CTC fra blodlegemer og gjør det også mulig å identifisere CTC-undergrupper med distinkte uttrykks profiler for overflate markør. Denne svært tilpassbare prosedyren kan deretter videre kombineres med spesifikke nedstrøms applikasjoner.

Her beskriver vi en arbeidsflyt som starter fra et CTC-beriket produkt (innhentet med en hvilken som helst CTC-berikelse teknologi) og kombinerer flere tilnærminger for å få innsikt i CTC-biologi på en enkelt celle oppløsning. I et nøtteskall, vår arbeidsflyt muliggjør identifisering av enkelt CTC, CTC klynger og CTC-WBC klynger av Live immunostaining, etterfulgt av én celle mikromanipulering og nedstrøms analyse ved hjelp av ex vivo dyrking protokoller, enkelt celle sekvenser og in vivo metastasering-analyser.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer blodprøver fra pasientene ble utført ved signert informert samtykke fra deltakerne. Prosedyrer ble kjørt i henhold til protokollene EKNZ BASEC 2016-00067 og EK 321/10, godkjent av etisk og institusjonell gjennomgang styret (etikk Committee nordvest/sentral Sveits [EKNZ]), og i samsvar med erklæringen av Helsingfors. Alle prosedyrer om dyr ble utført i samsvar med institusjonelle og kantonale retningslinjer (godkjent muse protokoll #2781, kantonale veterinary…

Representative Results

Den presenterte arbeidsflyten tillater utarbeidelse av individuelle CTC, enten fra enkelt CTC eller separert fra CTC-klynger. CTC fra pasienter eller tumor-bærende mus er beriket av hele blod med tilgjengelige CTC-berikelse metoder og deretter farget med antistoffer mot kreft-assosiert markører (f. eks, EpCAM, grønn) og WBC-spesifikke markører (f. eks, CD45, rød) (figur 1a ). Beiset CTC produktet blir deretter overført til mikromanipulering stasjon var …

Discussion

Den molekylære karakterisering av CTC holder løftet om å forbedre vår forståelse av metastatisk prosess og veilede utviklingen av nye anti-metastasering terapier. Her gir vi en detaljert beskrivelse av protokollene som muliggjør CTC-mikromanipulering og nedstrøms analyse, inkludert både enkelt cellebasert funksjonelle analyser, gen uttrykks analyse og in vivo -transplantasjon for metastatisk potensial vurdering²⁰.

Blant de mest kritiske trinnene i vår …

Materials

Anti-human EpCAM-AF488	Cell Signaling Technology	CST5198	clone: VU1D9
1X DPBS	Invitrogen	14190169	no calcium, no magnisium
6-wells Ultra-low attachment plate	Corning	3471
Anti-human CD45-BV605	Biolegend	304041	clone: HI30
Anti-human EGFR-FITC	GeneTex	GTX11400	clone: ICR10
Anti-human HER2-AF488	Biolegend	324410	clone: 24D2
Anti-mouse CD45-BV605	Biolegend	103139	clone: 30-F11
BD Vacutainer K2EDTA	BD	366643	for human blood collection
Cell Celector	ALS	CC1001	core unit
CellD software	ALS		version 3.0
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02
Micro tube 1.3 mL K3EDTA	Sarstedt	41.3395.005	for mouse blood collection
PCR tubes	Corning	PCR-02-L-C
RLT Plus	Quiagen	1053393
SUPERase  In RNase Inhibitor	Thermo Fisher	AM2696	1 U/µL