Микроманипуляции циркулирующей опухолевой клетки для молекулярного анализа вниз по течению и метастатического потенциального оценивания
Summary
Здесь мы представляем интегрированный рабочий процесс для идентификации фенотипических и молекулярных особенностей, характеризующих циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК). Мы объединяем живые иммуноокрашивания и роботизированные микроманипуляции одиночных и кластерных КЦС с помощью единой ячейки на основе методов для анализа и оценки метастазирования способность посева.
Abstract
Кровь метастазов приходится большинство смертей, связанных с раком и включает в себя циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), которые успешно в создании новых опухолей в отдаленных местах. ЦОК находятся в крови пациентов как одиночные клетки (одиночные ЦОК) или как многоклеточные агрегаты (СТС кластеров и СТС-белые группы кровяных телец), с последним отображая выше метастатической способности. Помимо перечисления, фенотипический и молекулярный анализ чрезвычайно важен, чтобы вскрыть биологию КТК и выявить действенные уязвимости. Здесь, мы предоставляем подробное описание рабочего процесса, который включает в себя СТС иммуноокрашивания и микроманипуляции, ex естественных условиях культуры для оценки пролиферативного и выживания возможности отдельных клеток, и в естественных условиях метастазов образования анализов. Кроме того, мы предоставляем протокол для достижения диссоциации кластеров КТК в отдельные ячейки и исследование внутрикластерной неоднородности. С помощью этих подходов, например, мы точно количественно выживания и пролиферативного потенциала одного ЦОК и отдельных клеток в рамках КТК кластеров, что привело нас к наблюдению, что клетки в кластеры дисплей лучше выживания и распространения в ex естественных культурах по сравнению с одной ЦОК. в целом, наш рабочий процесс предлагает платформу для рассечения характеристик ЦОК на уровне одного ячейки, стремясь к идентификации метастазов соответствующих путей и лучшего понимания СТС биологии.
Introduction
Клиническое проявление метастазов в отдаленных органах представляет собой завершающую стадию прогрессирования рака и составляет более 90% смертей, связанных с раком1. Переход от локализованного к метастатическим заболеванием является многоступенчатый процесс, часто опосредованный циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК)2,3,4. Эти клетки сбрасывают из первичной опухоли в кровообращение и транспортируются в отдаленные органы, где они могут экстратравате и установить метастатические поражения5,6. Хотя твердые опухоли могут выпустить относительно большое количество ЦОК, большинство ЦОК суждено умереть, из-за высокой силы сдвига в обращении, аноки-опосредованной клеточной смерти, иммунного нападения или ограниченные возможности, чтобы адаптироваться к иностранной микросреде7. Таким образом, это имеет решающее значение для создания инструментов, которые позволяют рассечение молекулярных особенностей тех, ЦОК, которые наделены с метастазами-посевной способности. Недавние доклинические и клинические исследования показывают, что наличие и количество единичных ЦОК и КТК кластеров связано с худшим результатом у пациентов с различными типами твердых опухолей8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 -ое . КТК кластеры группы из двух или более ЦВК, прилагаемый друг к другу во время циркуляции и более эффективны в формировании метастазов по сравнению с одной ЦОК3,15,16. Ячейки внутри кластера поддерживают сильную адгезианию клеток через десмоссомы и адхеренс соединения, которые могут помочь преодолеть анаикис17,18. В последнее время мы наблюдали, что кластеризация ЦОК связано с гипомеэтилляции сайтов связывания для штемфее и связанных с распространением транскрипционных факторов, что приводит к увеличению способности успешно инициировать метастазирование19. СТС кластерной диссоциации приводит к реконструкции ключевых сайтов связывания, и, следовательно, подавление их метастатического потенциала19. Дополнительно к кластерам раковых клеток, ЦОК также может ассоциировать с лейкоцитов (чаще всего нейтрофилов) для поддержания высокого уровня распространения в обращении и увеличить их метастатическим потенциалом20. Тем не менее, биология ЦОК понимается только в части и несколько вопросов остаются открытыми, в том числе основные молекулярные особенности и уязвимости отдельных и кластерных клеток.
В последние годы было создано несколько стратегий, которые используют шаблоны выражения клеточной поверхности, а также физические свойства ЦВК для их изоляции21,22,23,24, 25. антиген-зависимые методы изоляции опираются в основном на экспрессию клеточной поверхности клеток эпителиальной адгезии (EpCam)26. Наиболее часто используемой и (в настоящее время) единственной одобренной FDA платформой для перечисления КТК является система CellSearch, которая основывается на двухэтапной процедуре для изолирования ЦОК21. На первом этапе плазменные компоненты удаляются с помощью центрифугирования, в то время как ЦОК улавливания с магнитной фермофлюидов в сочетании с анти-EpCAM антител. На втором шаге раствор, обогащенный КТК, окрашивается для нуклеажных (DAPI-положительных) клеток, выражающих цитокератин (CK)8,18,19, в то время как белые кровяные тельца (лейкоциты) идентифицируются с использованием Пан-лейкоцитарный маркер CD45. Наконец, захваченные клетки помещаются на интегрированной платформе скрининга и ЦОК идентифицируются через выражение EpCAM, Рикс, и DAPI, будучи отрицательным для CD45. Несмотря на то, что это считается золотым стандартом для перечисления КТК, молекулярный анализ ниже по течению является сложной задачей с помощью этой технологии из-за присущих им ограничений поиска КТК. Кроме того, с учетом его процедуры изоляции, CellSearch может способствовать обогащению ЦОК с более высокими уровнями EpCAM по сравнению с ЦОК с более низким EpCAM выражение, из-за, например, гетерогенность рака27 или Даунрегуляция эпителиальных маркеров 28,29. Для преодоления этих ограничений появились антиген-независимые технологии обогащения ЦОК. Например, “СТС-чип” интегрирует гидродинамическая разделение нуклеированных ячеек, включая ЦВК и лейкоциты из оставшихся компонентов крови, а затем иммуномагнетик истощение антител, отмеченных лейкоцитов, что позволяет очистить немаркированные и жизнеспособные ЦОК в решение25. Кроме того, тот факт, что большинство ЦОК немного больше, чем красных кровяных телец (эритроцитов) или лейкоцитов привело к развитию на основе размера КТК технологий обогащения23,30 (например, система парсоркс (угол)), которая делает использование микрофлюидическая технология, включающая сужение канала через разделение кассеты, ведущие ячейки к терминальным пробелом 10, 8, 6,5 или 4,5 мкм (различные размеры доступны в зависимости от ожидаемого диаметра целевых раковых клеток). Большая часть клеток крови проходит через узкий зазор, в то время как ЦОК попадают в ловушку из-за их размера (но также из-за их нижней деформируемого) и, следовательно, сохраняются в кассете. Возврат направления потока позволяет выпустить захваченные ЦОК, которые находятся в жизнеспособное состояние и подходит для нисходящего анализа. Независимо от выбранного протокола для изоляции КТК, однако, типичные после обогащения процедуры по-прежнему дают ЦВК, которые смешиваются с относительно небольшим числом эритроцитов и кровяных телец, что делает анализ чистой одной или объемных ЦОК сложным. Для решения этой проблемы, мы создали рабочий процесс, который позволяет КТК манипуляции без потенциальной предвзятости, введенных загрязняющих клеток крови. Добавление иммуноокрашивания заранее, с переменными антителами-комбинациями, отличает ЦОК от клеток крови и даже позволяет идентифицировать КТК подгрупп с отдельными поверхностными маркером выражения профилей. Эта высоко настраиваемая процедура может быть затем дополнительно объединено с конкретными нижестоящих приложениями.
Здесь мы описываем рабочий процесс, который начинается с продуктов, обогащенных КТК (полученных с помощью любой технологии по обогащению КТК), и сочетает в себе несколько подходов для получения понимания СТС биологии при разрешении одной ячейки. В двух словах, наш рабочий процесс позволяет идентификации одного ЦОК, СТС кластеров и КТК-WBC кластеров в прямом эфире иммуноокрашивания, а затем одноклеточных микроманипуляции и нисходящего анализа с использованием ex естественных условиях культивирования протоколов, одной ячейки последовательности, и в естественных условиях метастазов анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Молекулярная характеристика ЦОК имеет обещание улучшить наше понимание метастатического процесса и направлять развитие новых анти-метастазов терапии. Здесь мы предоставляем подробное описание тех протоколов, которые позволяют анализ микроманипуляции и нисходящего анализа, включая…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех пациентов, которые пожертвовали кровью для нашего исследования, а также всех участвующих клиницистов и обучение медсестер. Мы благодарим Дженса Эберхардта, Уве бирке и д-ра Катарины Ухыг из решений ALS автоматизированная лаборатория GmbH для непрерывной поддержки. Мы благодарим всех членов лаборатории ацето за обратную связь и обсуждения. Исследования в лаборатории ацето поддерживаются Европейским исследовательским советом, Европейским союзом, Швейцарским национальным научным фондом, швейцарской онкологической Лигой, Базельской онкологической Лигой, двумя кантонами Базеля через Цюрих, и Базельским университетом.
Materials
| Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
| 1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
| 6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
| Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
| Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
| Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
| BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
| Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
| CellD software | ALS | version 3.0 | |
| Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
| Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
| PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
| RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
| SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |
Riferimenti
- Talmadge, J. E., Fidler, I. J. AACR centennial series: the biology of cancer metastasis: historical perspective. Ricerca sul cancro. 70 (14), 5649-5669 (2010).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Aceto, N., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. En Route to Metastasis: Circulating Tumor Cell Clusters and Epithelial-to-Mesenchymal Transition. Trends in Cancer. 1 (1), 44-52 (2015).
- Hong, Y., Fang, F., Zhang, Q. Circulating tumor cell clusters: What we know and what we expect (Review). International Journal of Oncology. 49 (6), 2206-2216 (2016).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Review Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Pantel, K., Speicher, M. R. The biology of circulating tumor cells. Oncogene. 35 (10), 1216-1224 (2016).
- Hou, J. M., et al. Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (5), 525-532 (2012).
- Long, E., et al. High expression of TRF2, SOX10, and CD10 in circulating tumor microemboli detected in metastatic melanoma patients. A potential impact for the assessment of disease aggressiveness. Cancer Medicine. 5 (6), 1022-1030 (2016).
- Wang, C., et al. Longitudinally collected CTCs and CTC-clusters and clinical outcomes of metastatic breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (1), 83-94 (2017).
- Mu, Z., et al. Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 154 (3), 563-571 (2015).
- Zhang, D., et al. Circulating tumor microemboli (CTM) and vimentin+ circulating tumor cells (CTCs) detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy. Cancer Cell International. 17, 6 (2017).
- Zheng, X., et al. Detection of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor Microemboli in Gastric Cancer. Translational Oncology. 10 (3), 431-441 (2017).
- Chang, M. C., et al. Clinical Significance of Circulating Tumor Microemboli as a Prognostic Marker in Patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma. Clinical Chemistry. 62 (3), 505-513 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Cheung, K. J., et al. Polyclonal breast cancer metastases arise from collective dissemination of keratin 14-expressing tumor cell clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (7), E854-E863 (2016).
- Giuliano, M., et al. Perspective on Circulating Tumor Cell Clusters: Why It Takes a Village to Metastasize. Ricerca sul cancro. 78 (4), 845-852 (2018).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11, 33 (2016).
- Gkountela, S., et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding. Cell. 176 (1-2), 98-112 (2019).
- Szczerba, B. M., et al. Neutrophils escort circulating tumour cells to enable cell cycle progression. Nature. , (2019).
- Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician’s guide to breast cancer treatment?. Cancer Treatment Reviews. 41 (2), 144-150 (2015).
- Sarioglu, A. F., et al. A microfluidic device for label-free, physical capture of circulating tumor cell clusters. Nature Methods. 12 (7), 685-691 (2015).
- Xu, L., et al. Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System. PLoS One. 10 (9), e0138032 (2015).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Science Translational Medicine. 5 (179), 179ra147 (2013).
- Went, P. T., et al. Frequent EpCam protein expression in human carcinomas. Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).
- Soysal, S. D., et al. EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer. British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).
- Yu, M., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Mani, S. A., et al. The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells. Cell. 133 (4), 704-715 (2008).
- Zheng, S., et al. Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells. Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).
- Yu, M., et al. Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 345 (6193), 216-220 (2014).
