この方法は、標準化されたマイクロ流体プラットフォームにおける40の浸透した3Dマイクロ容器としてiPSC由来内皮細胞の培養を記述する。このプラットフォームは、アナストモシスや、スケーラブルで高スループットな方法での血管新芽の安定化を含む、3Dでの勾配駆動血管新生芽芽の研究を可能にします。
血管疾患の前臨床薬研究は、高スループットスクリーニングに修正可能な血管系のインビトロモデルを必要とします。しかし、十分なスループットを有する現在のインビトロスクリーニングモデルは生理学的関連性が限られており、インビトロからインビボへの所見の翻訳を妨げる。一方、マイクロ流体細胞培養プラットフォームは、インビトロで比類のない生理学的関連性を示しているが、多くの場合、必要なスループット、スケーラビリティおよび標準化を欠いている。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC-EC)由来の内皮細胞の血管新生を、灌流や勾配を含む生理的関連細胞微小環境で研究する堅牢なプラットフォームを実証する。iPSC-ICは、パターン化されたコラーゲン-1足場に対して40個の浸透3Dマイクロ容器として培養されます。血管新生因子の勾配の適用に際して、先端および茎細胞への分化および吸入可能な内腔の形成を含む血管新生の重要な特徴を研究することができる。蛍光トレーサー色素による灌流は、血管新生芽のアナストモシス中および後の透過性の研究を可能にする。結論として、この方法は、標準化されたスケーラブルな3D血管新生アッセイにおけるiPSC由来ECの実現可能性を示し、生理学的関連の培養条件を統合し、内で統合するために必要な堅牢性と拡張性を有するプラットフォームに組み合わせる薬物スクリーニングインフラ。
インビトロモデルは、血管疾患の新薬標的の発見と検証において基本的な役割を果たす。しかし、十分なスループットしか持っていない現在のインビトロスクリーニングモデルは、生理学的関連性1が限られており、インビトロからインビボへの所見の翻訳を妨げる。したがって、前臨床血管薬の研究を進めるためには、高スループットスクリーニングと生理学的に関連する3D細胞マイクロ環境を組み合わせた血管系の改良されたin vitroモデルが必要である。
過去10年以内に、血管系の体外モデルの生理学的関連性を高めるために大きな進歩が見られた。組織培養プラスチックなどの平らな表面に内皮細胞を培養する代わりに、内皮細胞をフィブリンやコラーゲンゲル2などの3D足場に埋め込むことができる。これらのマトリックス内において、内皮細胞は、マトリックス分解および内腔形成に関連するより生理学的に関連する表現型を示す。しかしながら、これらのモデルは、細胞微小環境からの重要な手がかりがまだ欠けているので、血管新生発芽の間に生じる多くのプロセスのサブセットのみを示す。
マイクロ流体細胞培養プラットフォームは、血管系のin vitroモデルの生理学的関連性をさらに高めるために独特に適している。例えば、内皮細胞はせん断ストレスにさらされ得るが、これは血管系にとって重要な生体力学的刺激である。また、微小流体内の流体を空間的に制御する可能性により、生体分子勾配3、4、5、6の形成が可能となる。このような勾配は、血管新生時の形成およびパターニング中の生体内において重要な役割を果たす。しかし、マイクロ流体細胞培養プラットフォームは、従来の2Dおよび3D細胞培養方法に対して比類のない生理学的関連性を示しているが、多くの場合、薬物スクリーニングに必要なスループット、スケーラビリティ、標準化に欠けている。7.また、これらのプラットフォームの多くは市販されていないので、エンドユーザーは8を使用する前にデバイスを微細加工する必要があります。これは、製造装置と技術的知識を必要とするだけでなく、品質管理のレベルを制限し、再現性9に悪影響を及ぼす。
現在までに、原発性ヒト内皮細胞は、インビトロ10で血管新生をモデル化するために最も広く使用されている細胞源のままである。しかしながら、原発ヒト細胞には、スクリーニングアプローチにおける日常的な適用を妨げる多くの制限がある。第一に、一次細胞由来培養物をスケールアップして拡大する可能性は限られている。したがって、大規模な実験では、異なるドナーからのバッチを使用する必要があり、ゲノムの違いやバッチ間の変動が生じる。第2に、いくつかの通路の後、一次内皮細胞は、一般に、インビトロ11、12で培養すると関連する特性を失う。
ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する内皮細胞は有望な代替手段である:それらは一次細胞に似ているが、より安定した遺伝子型を有するが、精密なゲノム編集にも適している。さらに、iPSCは自己更新が可能なため、ほぼ無制限の量で拡張できるため、iPSC由来の細胞は、インビトロスクリーニングモデル13内で使用するための一次細胞に代わる魅力的な代替手段となる。
ここでは、内皮細胞を、標準化された高スループットマイクロ流体細胞培養プラットフォームで、含皮3Dマイクロ容器として培養する方法について説明する。灌流は、堅牢な動作を保証し、アッセイのスケーラビリティを向上させるロッカープラットフォーム上にデバイスを配置することによって適用されます。微小血管が連続的に浸透し、血管新生因子の勾配にさらされるように、血管新生芽は、より生理学的に関連する細胞微小環境で研究される。プロトコルは(一次)内皮細胞14、15の多くの異なるソースと互換性がありますが、我々は、このアッセイの標準化を高め、その統合を容易にするために、ヒトiPSC由来のICを使用することに焦点を当てた血管薬の研究の中で.
この方法は、堅牢でスケーラブルなマイクロ流体細胞培養プラットフォーム内の40の浸透性内皮マイクロ容器の培養を記述する。従来の2Dおよび3D細胞培養法と比較して、この方法は、勾配および連続的な灌流を含む生理学的関連の細胞微小環境を、スクリーニングのための十分なスループットを有する3D細胞培養と組み合わせる方法を示す目的。
同等のマイクロ流体アッセイに比ぶ大きな利点の1つは、この方法が灌流用ポンプに依存せず、ロッカープラットフォームを使用してすべてのマイクロ流体ユニットで連続的な灌流を同時に誘導することです。これにより、アッセイが堅牢でスケーラブルであることが保証され、プレートをロッカープラットフォームに積み重ねることができます。重要なことに、すべてのマイクロ流体ユニットは個別にアドレス可能なままであり、これは用量応答曲線の生成を含む薬物スクリーニング内でこの方法を実施することを可能にする。さらに、ポンプなしで、イメージ投射および媒体の取り替えは(クロス)汚染のより少ないより少ないより簡単である。
この方法のもう一つの利点は、標準化された、事前に製造されたプラットフォームの使用であり、同等のマイクロ流体細胞培養プラットフォームは、エンドユーザーが製造する必要があります。この可用性は、他の学術および製薬研究グループの間でこのアッセイの採用を容易にし、標準化につながります。また、マイクロ流体プロトタイプとは異なり、384ウェルプレートインタフェースは、現在のラボ機器(例えば、アスピレータ、プレートハンドラ、マルチチャンネルピペット)との互換性を確保し、現在のスクリーニングインフラストラクチャ内の統合を容易にします。.
このアッセイを実行するには、いくつかの重要なステップがあります。コラーゲン-1ゲルは完全にゲルチャネルを充填する必要があります。ゲルローディング中に、この充填は、観察ウィンドウ(図2a)を介してマイクロ流体チャネルを検査するか、プレートを逆さまに反転させることによって観察できます(図1a参照)。充填中、コラーゲンゲルは、隣接する灌流チャネルに流れることなく、中心チャネルに留まるべきです。コラーゲン-1ゲルの品質は、適切なアッセイ性能のために重要であることに気づいた。粘度が高すぎるコラーゲン-1バッチは、ゲルチャネルの不完全な充填につながります。37°Cで重合の10分後、ゲルは均質で明確でなければなりません。コラーゲン-1が適切に保存されていない場合(例えば、冷蔵庫内の温度の変動による)、コラーゲンは明確に目に見える繊維形成を有するチャネル内で重合する。これは、血管新生因子を加えることなく、適切な内腔の発達なしに、ゲルにICの侵入をもたらす可能性があります。
細胞が播種されると、フィブロネクチンコーティング溶液はウェルから除去され、コーティング溶液で満たされたマイクロ流体チャネルのみを残します。マイクロ流体チャネルからのコーティング溶液の吸引は、ゲル破壊またはゲル吸引を引き起こす可能性がある。セルサスペンションは、このコーティング溶液を交換/変位させる必要があります。これは、セル懸濁液をチャネルに直接パイプ処理することで再現性の低いシード密度を示すので、パッシブポンプ法を使用して細胞懸濁液をシードする場合に最適です。
マイクロ容器がゲルに対して安定な単層を形成するので、これらの小さな違いは、結合に達するために必要な異なる時間をもたらすだけです。したがって、アッセイ開始点は、培養時間ではなく合流によって決定される。必要に応じて、培養時間はゲルに対して透明な単層が形成されるまで延長することができる。
井戸内では、気泡が井戸の不適切な充填によって閉じ込められることがあります(図2b参照)。これらの気泡は、デバイスがロッカープラットフォームに配置されている場合でも、媒体の流れを制限し、マイクロ容器の崩壊と不適切な勾配形成をもたらす。井戸の側壁にピペットの先端を押すと、井戸を完全に充填する成功が増加します。気泡が井戸内に閉じ込められている場合は、無菌ピペットチップをガラス底にそっと挿入することで除去できます。気泡は、マイクロ流体チャネル内でも発生する可能性があります。培地が井戸から取り除かれると、30分後(チャネル内のマイクロリットル体積による)後にマイクロ流体チャネルから媒体の蒸発が顕著になる。従って、中程度の変化は、可能な限り速やかに行うことが好ましい。蒸発した媒体を持つチャネルに媒体を加えると、気泡はマイクロ流体チャネル内に閉じ込められる。マイクロ流体チャネル内のこれらの気泡は、P20ピペットを入口または出口に直接配置し、反対側のウェルからマイクロ流体を介して媒体を強制することによって手動で除去することができる。気泡の除去に成功すると、他の井戸の体積が小さいながらも顕著に減少します。表 1に、一般的なエラーとそのトラブルシューティング方法を示します。
ロッカープラットフォームは、連続的な時間間隔で画像にユーザーを制限するので、ポンプの欠如は、連続的なイメージングが必要な場合の制限です。さらに、このプラットフォームの媒体の灌流は、せん断応力のレベルが低い双方向の流れから成り、生体内の血管系は、より高いレベルのせん断応力を伴う単方向の流れにさらされます。血管新生発芽に関する双方向流れの悪影響は観察しませんが、流れは重要な生体力学的刺激であり、好ましくは制御されます。しかし、市販のポンプセットアップがありますが、384ウェルプレートとのインターフェースは依然として困難であり、ポンプのセットアップはこのアッセイのスケーラビリティを著しく妨げます。
iPSC-ICを使用して血管新生発芽を研究する可能性は、疾患モデリングと薬物研究の新たな機会を開きます。一次ICとは対照的に、これらの細胞は安定した遺伝子型を持つほぼ無限の量で生成することができ、ゲノム編集技術を使用することで、遺伝子ノックアウトやノックインを含む細胞を生成することができます。ただし、IC と iPSC を区別するプロトコルは比較的新しいため、プライマリ EC を最もよく反映する iPSC-EC につながるもの、およびどのサブタイプを生成できるかはまだ不明です。また、彼らの関連性に関する疑問はまだ残っています。例えば、iPSC-ECは、内皮細胞に典型的な可塑性を示しているのでしょうか?そして、iPSC由来の細胞はどの程度まで細胞の微小環境に反応し、相互作用するのか?ここで紹介する標準化されたプラットフォームは、iPSC 派生 EC の vitro の使用状況をさらに検証するために、これらの質問の一部に答えるために使用できます。
このアッセイの最も簡単な将来の方向性は、骨球やマクロファージなどの血管新生の間に重要な役割を果たす他の細胞型の統合であろう。これは、新芽間のアナストモシス中のマクロファージの役割または毛細血管形成後のペリサイトの付着を研究する能力を促進する。また、細胞外マトリックス内または細胞外マトリックスに対して様々な他の細胞型を培養することが可能である(例えば、我々はニューロンおよび近位尿細管および小腸のような種々の上皮構造の培養を示した)、血管と組み合わせることができるこの方法を使用して生成されたベッド。最後に、合成ヒドロゲルの血管新生芽を研究することは興味深いものであり、その定義された組成物はアッセイの標準化をさらに増加させ、細胞とマトリックスの相互作用に影響を与える剛性および結合動機のチューニングを可能にするので、興味深い。
結論として、この方法は、標準化されたスケーラブルな3D血管新生アッセイにおけるiPSC由来ECの実現可能性を示し、生理学的関連の培養条件を統合し、内で統合するために必要な堅牢性と拡張性を有するプラットフォームに組み合わせる薬物スクリーニングインフラ。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、オランダ保健研究開発機構(ZonMw)の「ミーア・ケニスがミンダー・ディエレンに会った」プログラム(プロジェクト番号114022501)とオランダ心臓財団CVONコンソーシアム助成金の研究助成によって一部支援されています。再接続。
0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
Basal culture medium | NCardia | ||
Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
dPBS | Gibco | 14190-094 | |
Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
HBSS | Gibco | 14025-050 | |
Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |