Denne metoden beskriver kulturen i iPSC-avledet endothelial celler som 40 perfusert 3D microårene i en standardisert mikrovæskebasert plattform. Denne plattformen muliggjør studiet av gradient-drevet angiogenic spirende i 3D, inkludert anastomose og stabilisering av angiogenic spirer i en skalerbar og høy gjennomstrømming måte.
Pre-klinisk narkotika forskning av vaskulære sykdommer krever in vitro-modeller av blodkar som er amendable til høy gjennomstrømming screening. Men nåværende in vitro screening modeller som har tilstrekkelig gjennomstrømming bare har begrenset fysiologisk relevans, noe som hindrer oversettelsen av funnene fra in vitro til in vivo. På den annen side, mikrovæskebasert cellekultur plattformer har vist enestående fysiologiske relevans in vitro, men ofte mangler den nødvendige gjennomstrømning, skalerbarhet og standardisering. Vi viser en robust plattform for å studere angiogenese av endothelial celler avledet fra humane Pluripotent stamceller (iPSC-ECs) i fysiologiske, relevante cellulære mikromiljøet, inkludert og graderinger. IPSC-ECs er kultivert som 40 perfusert 3D-microårene mot et mønstret kollagen-1-stillas. Ved anvendelsen av en gradient av angiogenic faktorer, kan viktige kjennetegn ved angiogenese bli studert, inkludert differensiering i tip-og stilk cellen og dannelsen av perfusable lumen. Med fluorescerende Tracer fargestoffer muliggjør studiet av permeabilitet under og etter anastomose av angiogenic spirer. Som konklusjon, denne metoden viser muligheten for iPSC-avledet ECs i en standardisert og skalerbar 3D-angiogenic analysen som kombinerer fysiologiske relevante kultur forhold i en plattform som har den nødvendige robusthet og skalerbarhet for å bli integrert i stoffet screening infrastruktur.
In vitro-modeller spiller en fundamental rolle i oppdagelse og validering av nye narkotika mål av vaskulære sykdommer. Men gjeldende in vitro screening modeller som har tilstrekkelig gjennomstrømming bare har begrenset fysiologisk relevans1, som hindrer oversettelsen av funnene fra in vitro til in vivo. Derfor, for å fremme pre-klinisk vaskulær narkotika forskning, forbedret in vitro modeller av blodkar er nødvendig som kombinerer høy gjennomstrømming screening med en fysiologisk relevant 3D Cellular mikro-miljø.
I løpet av det siste tiåret har det blitt gjort betydelige fremskritt for å øke den fysiologiske relevansen til in vitro-modeller av blodkar. I stedet for dyrking endothelial celler på flate overflater som vev-kulturen plast, endothelial celler kan bygges inn i 3D stillaser, slik som fibrin og kollagen gels2. Innenfor disse matriser, endothelial cellene viser en mer fysiologisk relevant fenotype forbundet med matrise degradering og lumen formasjon. Imidlertid, disse modeller bare demonstrere en undergruppe av det mange prosesser det finnes i løpet av angiogenic spirende idet betydelig stikkordene fra det cellular mikromiljøet er fremdeles mangler.
Mikrovæskebasert cellekultur plattformer er unikt egnet til ytterligere å øke den fysiologiske relevansen til in vitro-modeller av blodkar. For eksempel kan endothelial celler bli utsatt for skjær stress, som er en viktig biomekaniske stimulans for blodkar. Dessuten tillater muligheten til å romlig kontroll væsker innenfor materialer dannelsen av Biomolecular graderinger3,4,5,6. Slike graderinger spiller en viktig rolle i vivo under dannelsen og mønsteret under angiogenese. Men mens mikrovæskebasert cellen kultur plattformer har vist enestående fysiologiske relevans over tradisjonelle 2D og 3D cellekultur metoder, de ofte mangler den nødvendige gjennomstrømning, skalerbarhet og standardisering som kreves for narkotika screening 7. også, mange av disse plattformene er ikke kommersielt tilgjengelig og krever sluttbrukere å microfabricate sine enheter før bruk8. Dette krever ikke bare produksjons apparater og teknisk kunnskap, men begrenser også nivået av kvalitetskontroll og påvirker negativt reproduserbarhet9.
Hittil primære menneskelige endothelial celler forblir den mest brukte cellen kilde til modell angiogenese in vitro10. Men primære menneskelige celler har en rekke begrensninger som hindrer deres rutine anvendelse i screening tilnærminger. Først er det en begrenset mulighet til å skalere opp og utvide primær celle-avledet kulturer. Derfor, for stor skala eksperiment, batcher fra ulike givere må brukes, noe som resulterer i genomisk forskjeller og batch-to-batch variasjoner. For det andre, etter noen få passasjer, mister primære endothelial celler vanligvis relevante egenskaper når kultivert i vitro11,12.
Endothelial celler avledet fra menneskeskapte Pluripotent stamceller (iPSC) er et lovende alternativ: de ligner primære celler, men med en mer stabil genotype som også er mottagelig for presise Genova redigering. Videre iPSCs er i stand til selv-fornyelse og dermed kan utvides i nesten ubegrensede mengder, noe som gjør iPSC-avledede celler et attraktivt alternativ til primær celler for bruk innenfor in vitro screening modeller13.
Her beskriver vi en metode for å kultur endothelial celler som perfusable 3D-microårene i en standardisert, høy gjennomstrømming mikrovæskebasert cellekultur plattform. Bruk ved å plassere enheten på en rocker-plattform, som sikrer robust drift og øker skalerbarheten til analysen. Som microårene er kontinuerlig perfusert og utsatt for en gradient av angiogenic faktorer, angiogenic spirende er studert i en mer fysiologisk relevant mobilnettet mikromiljøet. Mens protokollen er kompatibel med mange forskjellige kilder til (Primær) endothelial celler14,15, fokuserte vi på å bruke humant IPSC-avledet ECs for å øke standardisering av denne analysen og for å lette sin integrering innenfor vaskulær narkotika forskning.
Denne metoden beskriver kulturen i 40 perfusable endothelial microårene innenfor en robust og skalerbar mikrovæskebasert cellekultur plattform. Sammenlignet med tradisjonelle 2D og 3D cellekultur metoder, viser denne metoden hvordan en fysiologisk relevant cellulær mikromiljøet som inkluderer graderinger og kontinuerlig produksjon kan kombineres med 3D cellekultur med tilstrekkelig gjennomstrømming for screening Formål.
En av de store fordelene sammenlignet med sammenlignbare mikrovæskebasert analyser er at denne metoden ikke er avhengig av pumper for bruk, men bruker en rocker-plattform for å indusere kontinuerlig bruk i alle mikrovæskebasert enheter samtidig. Dette sikrer at analysen er robust og skalerbar: platene kan stables på en rocker plattform. Viktigere, alle mikrovæskebasert enheter forblir individuelt adresserbare, som gjør at denne metoden skal gjennomføres innenfor narkotika screening inkludert generering av en dose-respons kurve. Videre, uten en pumpe, er Imaging og medium erstatning langt enklere med mindre risiko for (cross)-forurensning.
En annen fordel med denne metoden er bruk av en standardisert, pre-produsert plattform, mens sammenlignbare mikrovæskebasert cellekultur plattformer må fabrikkert av sluttbrukerne. Denne tilgjengeligheten forenkler innføringen av denne analysen blant andre akademiske og farmasøytiske forskningsgrupper, som fører til standardisering. I motsetning til mikrovæskebasert prototyper sikrer også 384-brønn plate grensesnittet kompatibilitet med gjeldende laboratorieutstyr (f.eks. aspirators, plate handlers og flerkanals Pipetter), og forenkler integreringen innenfor gjeldende screening-infrastruktur. .
Det er flere viktige trinn i å utføre denne analysen. Kollagen-1 gel skal fylle gel kanalen helt. Under gel lasting, kan denne fylling observeres ved å inspisere mikrovæskebasert kanaler enten gjennom observasjon vinduet (figur 2a) eller ved å bla platen opp ned (som vist i figur 1a). Under fylling bør kollagen gel forbli i senterkanalen, uten å strømme inn tilstøtende kanaler. Vi la merke til at kvaliteten på kollagen-1 gel er avgjørende for riktig analysen ytelse. Kollagen-1-batcher med for høy viskositet vil føre til ufullstendig fylling av gel-kanalen. Etter 10 min av polymerisering ved 37 ° c, skal gelen være homogen og klar. Hvis kollagen-1 ikke er lagret riktig (for eksempel på grunn av varierende temperaturer i kjøleskapet), vil kollagen polymeres i kanalene med klart synlig fiber formasjon. Dette kan føre til invasjon av ECs i gelen uten tilsetning av angiogenic faktorer, men uten riktig lumen utvikling.
Når cellene er sådd, fibronektin belegg løsningen er fjernet fra brønnene, slik at bare de mikrovæskebasert kanaler fylt med belegg løsning. Aspirasjon av belegget løsning fra mikrovæskebasert kanaler kan forårsake gel avbrudd eller gel aspirasjon. Celle suspensjonen må erstatte/fortrenge dette belegget løsning. Dette fungerer best når cellen suspensjonen er sådd ved hjelp av passiv pumping metoden, som direkte pipettering cellen suspensjonen inn i kanalene viser mindre reproduserbar seeding tettheten.
Som microårene danner en stabil monolag mot gel, disse små forskjellene bare resultere i ulike tider som trengs for å nå confluency. Dermed er analysen startpunktet bestemmes av confluency stedet kultur tid. Om nødvendig kan dyrking tid utvides til en klar monolag er formet mot gelen.
Innenfor brønnene kan luftbobler fanges av feilfylling av brønnene (se figur 2b). Disse luftboblene vil begrense flyten av medium, selv når enheten er plassert på en rocker plattform, og resultere i kollaps av microvessel og uriktig gradient formasjon. Å trykke på pipette spissen mot sideveggen av brønnene vil øke suksessen til helt fylle brønnen. Hvis en luftboble er fanget i brønnene, kan den fjernes ved å forsiktig sette inn en steril pipette spiss i glass bunnen. Luftbobler kan også forekomme i de mikrovæskebasert kanalene. Når medium er fjernet fra brønnene, er fordampning av medium merkbar fra mikrovæskebasert kanaler etter 30 min (på grunn av mikroliter volumer i kanalene). Dermed blir middels endringer fortrinnsvis utført så raskt som mulig. Når medium legges til i en kanal med fordampet medium, vil luftbobler bli fanget inne i de mikrovæskebasert kanalene. Disse luftbobler innenfor mikrovæskebasert kanaler kan fjernes manuelt ved å plassere en P20 pipette direkte på enten innløp eller utløp og tvinge medium gjennom materialer fra motsatt brønnen. Vellykket fjerning av luftbobler resulterer i en liten, men merkbar reduksjon i volum i den andre brønnen. Tabell 1 lister opp vanlige feil og hvordan du feilsøker dem.
Mangelen på en pumpe er en begrensning når kontinuerlig bildebehandling er nødvendig, som rocker plattformen begrenser brukeren til bildet på sekvensielle tidsintervaller. Videre består mengden av medium i denne plattformen av toveis flyt med lave nivåer av skjær stress, mens blodkar in vivo er eksponert for enveis flyt med høyere nivåer av skjær stress. Selv om vi ikke observerer negative effekter av toveis flyt med hensyn til angiogenic spirende, flyt er en viktig biomekaniske stimulans og fortrinnsvis kontrollert. Men mens det er kommersielt tilgjengelige pumpen oppsett, grensesnitt med 384-brønn plate fortsatt utfordrende og pumpe oppsett alvorlig hemme skalerbarhet av denne analysen.
Muligheten til å bruke iPSC-ECs til å studere angiogenic spirende åpner for nye muligheter i sykdoms modellering og narkotika forskning. I motsetning til primære ECs, disse cellene kan genereres i nesten ubegrensede mengder med en stabil genotype og ved hjelp av Genova redigering teknikker, celler kan genereres som inkluderer gen Knockouts og knock-ins. Imidlertid, idet protokollene å skille ut ECs fra iPSC er relativt ny, det er en fremdeles uklarert hva innlede å iPSC-ECs det best reflektere primære ECs og hvilke under typer av EF er eller kan utviklet. Dessuten er det fortsatt gjenværende spørsmål om relevans deres. For eksempel gjør iPSC-ECs fortsatt viser plastisitet som er typisk for endothelial celler? Og i hvilken grad gjør iPSC-avledede celler reagerer på og samhandler med sine cellulære mikromiljøet? Den standardiserte plattformen som presenteres her kan brukes til å besvare noen av disse spørsmålene for å ytterligere validere bruken av iPSC-avledet ECs in vitro.
Den mest rett fram fremtiden retning for denne analysen vil være integreringen av andre celletyper som spiller en viktig rolle under angiogenese, slik som pericytes og makrofager. Dette vil lette evnen til å studere rollen til makrofager under anastomose mellom spirer eller overholdelse av pericytes etter kapillær dannelse. Dessuten er det mulig å kultur ulike andre celletyper innenfor eller mot en ekstracellulære matrise (f. eks, har vi vist kulturen av neurons og ulike epitel strukturer som proksimale tubuli og små tarmen), som kan kombineres med vaskulære senger generert ved hjelp av denne metoden. Til slutt vil det være interessant å studere angiogenic spirende i syntetiske hydrogeler, som deres definerte sammensetning ytterligere øker standardisering av analysen og tillater tuning av stivhet og bindende motiver som påvirker celle-matrise interaksjoner.
Som konklusjon, denne metoden viser muligheten for iPSC-avledet ECs i en standardisert og skalerbar 3D-angiogenic analysen som kombinerer fysiologiske relevante kultur forhold i en plattform som har den nødvendige robusthet og skalerbarhet for å bli integrert i stoffet screening infrastruktur.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er delvis støttet av et forskningsstipend fra ‘ Meer Kennis møtte assistenten Dieren ‘ program (prosjektnummer 114022501) av Nederland organisasjon for helse forskning og utvikling (ZonMw) og den nederlandske Heart Foundation CVON konsortium stipend Koble.
0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
Basal culture medium | NCardia | ||
Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
dPBS | Gibco | 14190-094 | |
Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
HBSS | Gibco | 14025-050 | |
Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |