Denna metod beskriver kulturen av IPSC-härledda endotelceller som 40 perfunderade 3D microkärl i en standardiserad mikroflödessystem plattform. Denna plattform gör det möjligt att studera gradientdriven angiogen groning i 3D, inklusive anastomos och stabilisering av angiogena groddar i ett skalbart och högt dataflöde sätt.
Preklinisk läkemedelsforskning av vaskulära sjukdomar kräver in vitro-modeller av kärl som är omprövnings bara för hög genomströmning screening. Aktuella in vitro-screening modeller som har tillräcklig genomströmning har dock endast begränsad fysiologisk relevans, vilket hindrar översättningen av fynd från in vitro till in vivo. Å andra sidan, mikroflödessystem cellkultur plattformar har visat oöverträffad fysiologiska relevans in vitro, men ofta saknar den nödvändiga genomströmning, skalbarhet och standardisering. Vi visar en robust plattform för att studera angiogenes av endotelceller härledda från humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC-ECs) i en fysiologisk relevant cellulär mikromiljö, inklusive perfusion och gradienter. IPSC-ECs odlas som 40 perfunderade 3D microfartyg mot en mönstrad kollagen-1 byggnadsställning. Vid applicering av en gradient av angiogena faktorer, kan viktiga kännetecken för angiogenes studeras, inklusive differentiering i spets-och stjälk cell och bildandet av perfusable lumen. Perfusion med fluorescerande Tracer färgämnen gör det möjligt att studera permeabilitet under och efter anastomos av angiogena groddar. Sammanfattningsvis visar denna metod genomförbarheten av iPSC-härledda ECs i en standardiserad och skalbar 3D angiogen analys som kombinerar fysiologiska relevanta odlingsförhållanden i en plattform som har erforderlig robusthet och skalbarhet som ska integreras i infrastrukturen för läkemedels screening.
In vitro-modeller spelar en grundläggande roll i upptäckten och validering av nya läkemedel mål av vaskulära sjukdomar. Aktuella in vitro-screening modeller som har tillräcklig genomströmning har dock endast begränsad fysiologisk relevans1, vilket hindrar översättningen av fynd från in vitro till in vivo. Således, för att främja prekliniska vaskulär läkemedelsforskning, förbättrade in vitro-modeller av kärl är nödvändiga som kombinerar hög genomströmning screening med en fysiologiskt relevant 3D cellulära mikro-miljö.
Inom det senaste decenniet har betydande framsteg gjorts för att öka den fysiologiska relevansen av in vitro-modeller av kärl. Istället för att odla endotelceller på plana ytor som vävnadsodling kan endotelceller bäddas in i 3D-ställningar, såsom fibrin och kollagen Gels2. Inom dessa matriser, endotelcellerna visar en mer fysiologiskt relevant fenotyp i samband med matris nedbrytning och lumen bildas. Dessa modeller visar dock bara en delmängd av de många processer som uppstår under angiogen groning som viktiga ledtrådar från den cellulära mikromiljön saknas fortfarande.
Mikrofluidiska cellkulturplattformar är unikt lämpade för att ytterligare öka den fysiologiska relevansen av in vitro-modeller av kärl. Till exempel, endotelceller kan utsättas för skjuvning stress, vilket är en viktig biomekanisk stimulans för kärl. Även möjligheten att rumsligt kontrollera vätskor inom mikrofluidik tillåter bildandet av biomolekylära gradienter3,4,5,6. Sådana gradienter spelar en viktig roll in vivo under bildandet och mönstringen under angiogenes. Men medan mikroflödessystem cellkultur plattformar har visat oöverträffad fysiologiska relevans över traditionella 2D-och 3D-cellkultur metoder, de saknar ofta den nödvändiga genomströmning, skalbarhet och standardisering som krävs för Drug screening 7. Dessutom är många av dessa plattformar inte kommersiellt tillgängliga och kräver slutanvändare att microfabricate sina enheter före användning8. Detta kräver inte bara tillverkande apparatur och teknisk kunskap, utan begränsar också kvalitetskontrollens nivå och inverkar negativt på reproducerbarheten9.
Hittills är primära humana endotelceller fortfarande den mest använda cell källan för att modellera angiogenes in vitro10. Emellertid, primära mänskliga celler har ett antal begränsningar som hindrar deras rutinmässig tillämpning i screeningmetoder. För det första finns det en begränsad möjlighet att skala upp och expandera primära cell-härledda kulturer. För storskaliga experiment måste därför partier från olika givare användas, vilket leder till genomiska skillnader och variationer i parti-till-sats. För det andra, efter några passager, primära endotelceller förlorar i allmänhet relevanta egenskaper när odlade in vitro-11,12.
Endotelceller som härrör från humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) är ett lovande alternativ: de liknar primära celler, men med en stabilare genotyp som också är mottagliga för exakt genom redigering. Dessutom kan iPSCs självförnya och därmed utökas i nästan obegränsade kvantiteter, vilket gör iPSC-härledda celler till ett attraktivt alternativ till primära celler för användning inom in vitro-screening modeller13.
Här beskriver vi en metod för att odla endotelceller som perfusable 3D microfartyg i en standardiserad, hög genomströmning mikroflödessystem cellkultur plattform. Perfusion appliceras genom att placera enheten på en rocker plattform, vilket garanterar robust drift och ökar skalbarheten i analysen. Eftersom mikrokärlen kontinuerligt är parfymiserade och utsätts för en gradient av angiogena faktorer studeras angiogen groning i en mer fysiologisk relevant cellulär mikromiljö. Medan protokollet är förenligt med många olika källor av (primära) endotelceller14,15, fokuserade vi på att använda humant IPSC-härledda ECs för att öka standardiseringen av denna analys och för att underlätta dess integration inom vaskulär läkemedelsforskning.
Denna metod beskriver kulturen i 40 perfusable endoteliala mikrofartyg inom en robust och skalbar mikroflödessystem cellkultur plattform. Jämfört med traditionella 2D-och 3D-cellkulturmetoder visar denna metod hur en fysiologisk relevant cellulär mikromiljö som inkluderar gradienter och kontinuerlig perfusion kan kombineras med 3D-cellkultur med adekvat genomströmning för screening Ändamål.
En av de stora fördelarna jämfört med jämförbara mikroflödessystem analyser är att denna metod inte förlitar sig på pumpar för perfusion men använder en rocker plattform för att inducera kontinuerlig perfusion i alla mikroflödessystem enheter samtidigt. Detta säkerställer att analysen är robust och skalbar: plattorna kan staplas på en rocker plattform. Viktigt är att alla mikroflödessystem enheter förblir individuellt adresserbara, vilket gör att denna metod som skall genomföras inom läkemedels screening inklusive generering av en dos-responskurva. Dessutom, utan en pump, avbildning och medelstora ersättare är mycket enklare med mindre risk för (kors)-förorening.
En annan fördel med denna metod är användning av en standardiserad, pre-tillverkad plattform, medan jämförbara mikroflödessystem cellkultur plattformar måste tillverkas av slutanvändarna. Denna tillgänglighet underlättar antagandet av denna analys bland andra akademiska och farmaceutiska forskargrupper, vilket leder till standardisering. Till skillnad från mikrofluidiska prototyper säkerställer 384-well-plattgränssnittet kompatibilitet med den aktuella laboratorieutrustningen (t. ex. aspirare, platthanterare och flerkanalpipetter), vilket underlättar integrationen inom den nuvarande screening infrastrukturen .
Det finns flera kritiska steg för att utföra denna analys. Kollagen-1-gelen ska fylla gel kanalen helt. Vid laddning av gel kan denna fyllning observeras genom att inspektera de mikrofluidiska kanalerna antingen genom observations fönstret (figur 2A) eller genom att vrida plattan upp och ner (som visas i figur 1a). Medan fyllning, kollagen gel bör förbli i centrum kanalen, utan att strömma in i angränsande perfusion kanaler. Vi märkte att kvaliteten på kollagen-1 gel är avgörande för korrekt analys prestanda. Kollagen-1 partier med för hög viskositet kommer att leda till ofullständig fyllning av gel kanalen. Efter 10 min av polymerisation vid 37 ° c, bör gelen vara homogen och klar. Om kollagen-1 inte lagras på rätt sätt (t. ex. på grund av fluktuerande temperaturer i kylskåpet), kommer kollagen polymerisera inom kanalerna med tydligt synlig fiber bildning. Detta kan resultera i invasion av ECs i gelen utan tillsats av angiogena faktorer, men utan ordentlig lumen utveckling.
När cellerna är seedade avlägsnas Fibronektin-beläggningen från brunnarna, vilket innebär att endast de mikrofluidiska kanalerna fylls med beläggnings lösning. Aspiration av beläggnings lösningen från mikrofluidiska kanaler kan orsaka gel avbrott eller gel aspiration. Cellsuspensionen måste ersätta/tränga undan denna beläggnings lösning. Detta fungerar bäst när cellsuspensionen är seedad med hjälp av den passiva pump metoden, som direkt Pipettera cellsuspensionen i kanalerna visar mindre reproducerbara sådd tätheter.
Eftersom mikrokärlen bildar en stabil enskiktslager mot gelen, dessa små skillnader bara resultera i olika tider som behövs för att nå sammanlänkning. Således är analysens startpunkt bestäms av confluency snarare än kultur tid. Vid behov kan odlings tiden förlängas tills en klar enskiktslager har bildats mot gelen.
I brunnarna kan luftbubblor fastna genom felaktig fyllning av brunnarna (se figur 2b). Dessa luftbubblor kommer att begränsa flödet av medium, även när enheten är placerad på en rocker plattform, och resultera i kollaps av mikrokärl och felaktig lutning formation. Genom att trycka pipettspetsen mot sidovägg av brunnar kommer att öka framgången för att helt fylla brunnen. Om en luftbubbla fastnar i brunnarna kan den avlägsnas genom att försiktigt sätta in en steril pipettspets i glas bottnen. Luftbubblor kan också förekomma i mikrofluidiska kanaler. När mediet har tagits bort från brunnarna, är avdunstning av mediet märkbar från mikroflödessystem kanaler efter 30 min (på grund av mikroliter volymer inom kanalerna). Således utförs medelstora förändringar företrädesvis så snabbt som möjligt. När mediet tillsätts i en kanal med evaporerat medium kommer luftbubblor att fastna i de mikrofluidiska kanalerna. Dessa luftbubblor i mikrofluidiska kanaler kan avlägsnas manuellt genom att placera en P20 pipett direkt på antingen inloppet eller utlopp och tvinga medium genom mikrofluidik från motsatt brunn. Framgångsrik avlägsnande av luftbubblor resulterar i en liten men märkbar minskning av volymen i den andra brunnen. Tabell 1 visar vanliga fel och hur du felsöker dem.
Avsaknaden av en pump är en begränsning när kontinuerlig avbildning krävs, eftersom Rocker plattformen begränsar användaren till bild i sekventiella tidsintervall. Vidare, den perfusion av medium i denna plattform består av dubbelriktade flöde med låga nivåer av skjuvning stress, medan kärl in vivo utsätts för enkelriktade flöde med högre nivåer av skjuvning stress. Även om vi inte iakttar negativa effekter av det dubbelriktade flödet när det gäller angiogena Sprouting, är Flow en viktig biomekanisk stimulans och företrädesvis kontrollerad. Men medan det finns kommersiellt tillgängliga pump uppställningar, gränssnitt med 384-väl plattan fortfarande utmanande och pump uppställningar allvarligt hämma skalbarheten i denna analys.
Möjligheten att använda IPSC-ECs för att studera angiogen groning öppnar nya möjligheter inom sjukdomsmodellering och läkemedelsforskning. I motsats till primära ECs, dessa celler kan genereras i nästan obegränsade mängder med en stabil genotyp och genom att använda genomedigering tekniker, celler kan genereras som inklusive genknockouts och knock-ins. Eftersom protokollen för att särskilja ECs från iPSC är relativt nya är det dock fortfarande oklart vad som leder till iPSC-ECs som bäst återspeglar primära ECs och vilka undertyper av EG som är eller kan genereras. Dessutom finns det fortfarande kvarstående frågor om deras relevans. Exempelvis uppvisar iPSC-ECs fortfarande den plasticitet som är typisk för endotelceller? Och i vilken grad gör iPSC-härledda celler svara på och interagera med sina cellulära mikromiljö? Den standardiserade plattform som presenteras här kan användas för att besvara några av dessa frågor för att ytterligare validera användningen av iPSC-härledda ECs in vitro.
Den mest rättframma framtida riktningen för denna analys kommer att vara integrationen av andra celltyper som spelar en viktig roll under angiogenes, såsom pericyter och makrofager. Detta kommer att underlätta möjligheten att studera rollen av makrofager under anastomos mellan groddar eller vidhäftning av pericyter efter kapillärbildning. Också, det är möjligt att odla olika andra celltyper inom eller mot en extracellulär matris (t. ex., vi har visat kulturen av nervceller och olika epitelial strukturer såsom proximala tubuli och tunntarm), som kan kombineras med den vaskulära sängar som genereras med denna metod. Slutligen, det kommer att bli intressant att studera angiogena groning i syntetiska hydrogels, som deras definierade sammansättningen ytterligare ökar standardiseringen av analysen och tillåter trimning av stelhet och bindande motiv som påverkar cell-matris interaktioner.
Sammanfattningsvis visar denna metod genomförbarheten av iPSC-härledda ECs i en standardiserad och skalbar 3D angiogen analys som kombinerar fysiologiska relevanta odlingsförhållanden i en plattform som har erforderlig robusthet och skalbarhet som ska integreras i infrastrukturen för läkemedels screening.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete är delvis stöds av ett forskningsanslag från “Meer kennis met Minder Dieren” program (projektnummer 114022501) i den nederländska organisationen för hälsa forskning och utveckling (ZonMw) och den nederländska Heart Foundation CVON Consortium Grant Återansluta.
0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
Basal culture medium | NCardia | ||
Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
dPBS | Gibco | 14190-094 | |
Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
HBSS | Gibco | 14025-050 | |
Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |