Cette méthode décrit la culture des cellules endothéliales dérivées de l’iPSC comme 40 microvaisseaux 3D perfusés dans une plate-forme microfluidique normalisée. Cette plate-forme permet l’étude de la germination angiogénique à gradient en 3D, y compris l’anastomose et la stabilisation des germes angiogéniques d’une manière évolutive et à haut débit.
La recherche préclinique de médicaments sur les maladies vasculaires nécessite des modèles in vitro de vascularisation qui sont modifiables au dépistage à haut débit. Cependant, les modèles actuels de dépistage in vitro qui ont un débit suffisant n’ont qu’une pertinence physiologique limitée, ce qui entrave la traduction des résultats de l’in vitro à l’in vivo. D’autre part, les plates-formes de culture cellulaire microfluidique ont montré une pertinence physiologique inégalée in vitro, mais manquent souvent du débit, de l’évolutivité et de la normalisation nécessaires. Nous démontrons une plate-forme robuste pour étudier l’angiogenèse des cellules endothéliales dérivées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC-ECs) dans un microenvironnement cellulaire pertinent physiologique, y compris la perfusion et les gradients. Les iPSC-EC sont cultivés comme 40 micro-navires 3D perfused contre un échafaudage de collagène-1 à motifs. Sur l’application d’un gradient de facteurs angiogéniques, les caractéristiques importantes de l’angiogenèse peuvent être étudiées, y compris la différenciation dans la cellule de pointe et de tige et la formation du lumen perfusable. La perfusion avec des colorants fluorescents traceur permet l’étude de la perméabilité pendant et après l’anastomose des germes angiogéniques. En conclusion, cette méthode montre la faisabilité des EC dérivés de l’iPSC dans un analyse angiogénique 3D standardisée et évolutive qui combine les conditions physiologiques pertinentes de la culture dans une plate-forme qui a la robustesse et l’évolutivité requises pour être intégrée s’intégrer dans l’infrastructure de dépistage des drogues.
Les modèles in vitro jouent un rôle fondamental dans la découverte et la validation de nouvelles cibles médicamenteuses des maladies vasculaires. Cependant, les modèles actuels de dépistage in vitro qui ont un débit suffisant n’ont qu’une pertinence physiologique limitée1, ce qui entrave la traduction des résultats de l’in vitro à in vivo. Ainsi, pour faire avancer la recherche préclinique de drogue vasculaire, les modèles in vitro améliorés de vascularisation sont nécessaires qui combinent le criblage à haut débit avec un micro-environnement cellulaire 3D physiologiquement pertinent.
Au cours de la dernière décennie, des progrès significatifs ont été réalisés pour accroître la pertinence physiologique des modèles in vitro de vascularisation. Au lieu de cultiver des cellules endothéliales sur des surfaces planes telles que des plastiques de culture tissulaire, les cellules endothéliales peuvent être incorporées dans des échafaudages 3D, tels que les gels de fibrine et de collagène2. Dans ces matrices, les cellules endothéliales montrent un phénotype plus physiologiquement pertinent associé à la dégradation de matrice et à la formation de lumen. Cependant, ces modèles ne démontrent qu’un sous-ensemble des nombreux processus qui se produisent pendant la germination angiogénique car les indices importants du microenvironnement cellulaire font encore défaut.
Les plates-formes de culture cellulaire microfluidique sont particulièrement adaptées pour accroître encore la pertinence physiologique des modèles in vitro de vascularisation. Par exemple, les cellules endothéliales peuvent être exposées au stress de cisaillement, qui est un stimulus biomécanique important pour la vascularisation. En outre, la possibilité de contrôler spatialement les fluides dans la microfluidique permet la formation de gradients biomoléculaires3,4,5,6. Ces gradients jouent un rôle important in vivo lors de la formation et du modelage pendant l’angiogenèse. Cependant, alors que les plates-formes de culture cellulaire microfluidique ont fait preuve d’une pertinence physiologique inégalée par-dessus les méthodes traditionnelles de culture cellulaire 2D et 3D, elles n’ont souvent pas le débit, l’évolutivité et la normalisation nécessaires au dépistage des médicaments. 7. De plus, bon nombre de ces plates-formes ne sont pas disponibles dans le commerce et exigent que les utilisateurs finaux reproduisent leurs appareils avant d’utiliser8. Cela nécessite non seulement des appareils de fabrication et des connaissances techniques, mais limite également le niveau de contrôle de la qualité et affecte négativement la reproductibilité9.
À ce jour, les cellules endothéliales humaines primaires restent la source cellulaire la plus largement utilisée pour modéliser l’angiogenèse in vitro10. Cependant, les cellules humaines primaires ont un certain nombre de limitations qui entravent leur application courante dans les approches de criblage. Premièrement, il y a une possibilité limitée d’étendre et d’élargir les cultures d’origine cellulaire primaire. Ainsi, pour les expériences à grande échelle, des lots de différents donateurs doivent être utilisés, ce qui entraîne des différences génomiques et des variations de lot à lot. Deuxièmement, après quelques passages, les cellules endothéliales primaires perdent généralement des propriétés pertinentes lorsqu’elles sont cultivées in vitro11,12.
Les cellules endothéliales dérivées de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) sont une alternative prometteuse : elles ressemblent aux cellules primaires, mais avec un génotype plus stable qui est également propice à l’édition précise du génome. En outre, les iPSC sont capables de se renouveler eux-mêmes et peuvent donc être étendus en quantités presque illimitées, ce qui fait des cellules dérivées de l’iPSC une alternative attrayante aux cellules primaires pour une utilisation dans les modèles de dépistage in vitro13.
Ici, nous décrivons une méthode à la culture des cellules endothéliales comme micronavires 3D perfusables dans une plate-forme standardisée et à haut débit de culture microfluidique de cellules. La perfusion est appliquée en plaçant l’appareil sur une plate-forme de bascule, ce qui assure un fonctionnement robuste et augmente l’évolutivité de l’analyse. Comme les microvaisseaux sont continuellement perfusés et exposés à un gradient de facteurs angiogéniques, la germination angiogénique est étudiée dans un microenvironnement cellulaire plus physiologique pertinent. Bien que le protocole soit compatible avec de nombreuses sources différentes de cellules endothéliales (primaires)14,15, nous nous sommes concentrés sur l’utilisation d’ECs dérivés de l’iPSC humain afin d’augmenter la normalisation de cet test et de faciliter son intégration dans la recherche sur les médicaments vasculaires.
Cette méthode décrit la culture de 40 micronavires endothéliaux perfusables au sein d’une plate-forme de culture cellulaire microfluidique robuste et évolutive. Comparée aux méthodes traditionnelles de culture cellulaire 2D et 3D, cette méthode montre comment un microenvironnement cellulaire physiologique pertinent qui comprend des gradients et une perfusion continue peut être combiné avec la culture cellulaire 3D avec un débit adéquat pour le dépistage Fins.
L’un des principaux avantages par rapport aux essais microfluidiques comparables est que cette méthode ne repose pas sur des pompes pour la perfusion, mais utilise une plate-forme de bascule pour induire une perfusion continue dans toutes les unités microfluidiques simultanément. Cela garantit que l’analyse est robuste et évolutive : les plaques peuvent être empilées sur une plate-forme de bascule. Fait important, toutes les unités microfluidiques restent individuellement adressables, ce qui permet à cette méthode d’être mise en œuvre dans le cadre du dépistage des médicaments, y compris la génération d’une courbe dose-réponse. De plus, sans pompe, l’imagerie et le remplacement moyen sont beaucoup plus simples avec moins de risque de contamination (croisée).
Un autre avantage de cette méthode est l’utilisation d’une plate-forme normalisée et préfabriquée, tandis que des plates-formes comparables de culture cellulaire microfluidique doivent être fabriquées par les utilisateurs finaux. Cette disponibilité facilite l’adoption de cet analyse parmi d’autres groupes de recherche universitaire et pharmaceutique, conduisant à la normalisation. De plus, contrairement aux prototypes microfluidiques, l’interface de plaques de 384 puits assure la compatibilité avec l’équipement de laboratoire actuel (p. ex., aspirateurs, manutentionnaires de plaques et pipettes multicanaux), ce qui facilite l’intégration dans l’infrastructure de criblage actuelle. .
Il y a plusieurs étapes critiques dans l’exécution de cet analyse. Le gel de collagène-1 devrait remplir complètement le canal de gel. Pendant la charge du gel, cette obturation peut être observée en inspectant les canaux microfluidiques soit par la fenêtre d’observation (Figure 2a) ou en renversant la plaque à l’envers (comme le montre la figure 1a). Pendant le remplissage, le gel de collagène doit rester dans le canal central, sans couler dans les canaux de perfusion adjacents. Nous avons remarqué que la qualité du gel de collagène-1 est cruciale pour la bonne performance d’essai. Les lots de collagène-1 avec une viscosité trop élevée mèneront au remplissage incomplet du canal de gel. Après 10 min de polymérisation à 37 oC, le gel doit être homogène et clair. Si le collagène-1 n’est pas stocké correctement (p. ex., en raison des fluctuations des températures dans le réfrigérateur), le collagène polymérisera dans les canaux avec une formation de fibres clairement visible. Ceci peut avoir comme conséquence l’invasion des EC dans le gel sans addition des facteurs angiogéniques, mais sans le développement de lumen approprié.
Lorsque les cellules sont ensetcées, la solution de revêtement de fibronectine est retirée des puits, ne laissant que les canaux microfluidiques remplis de solution de revêtement. L’aspiration de la solution de revêtement à partir de canaux microfluidiques pourrait causer une perturbation du gel ou l’aspiration de gel. La suspension cellulaire doit remplacer/déplacer cette solution de revêtement. Cela fonctionne mieux lorsque la suspension cellulaire est ensemencée en utilisant la méthode de pompage passif, comme directement pipetting la suspension cellulaire dans les canaux montrent des densités d’ensemencement moins reproductibles.
Comme les micronavires forment une monocouche stable contre le gel, ces petites différences n’entraînent que des temps différents nécessaires pour atteindre la confluence. Ainsi, le point de départ de l’assidu est déterminé par la confluence plutôt que par le temps de culture. Si nécessaire, le temps de culture peut être prolongé jusqu’à ce qu’une monocouche claire ait été formée contre le gel.
Dans les puits, les bulles d’air peuvent être piégées par un remplissage incorrect des puits (voir figure 2b). Ces bulles d’air limiteront le flux du milieu, même lorsque l’appareil est placé sur une plate-forme de bascule, et entraîneront l’effondrement du micronavire et la formation de gradient incorrecte. Appuyer sur la pointe de la pipette contre le mur latéral des puits augmentera le succès de remplir complètement le puits. Si une bulle d’air est emprisonnée dans les puits, elle peut être enlevée en insérant doucement une pointe de pipette stérile dans le fond de verre. Des bulles d’air peuvent également se produire dans les canaux microfluidiques. Lorsque le milieu a été retiré des puits, l’évaporation du milieu est perceptible dans les canaux microfluidiques après 30 minutes (en raison des volumes de microlitres dans les canaux). Ainsi, les changements moyens sont de préférence effectués aussi rapidement que possible. Lorsque le milieu est ajouté dans un canal avec milieu évaporé, bulles d’air seront piégés dans les canaux microfluidiques. Ces bulles d’air dans les canaux microfluidiques peuvent être enlevées manuellement en plaçant une pipette P20 directement sur l’aurete ou la sortie et en forçant le milieu à travers les microfluidiques du puits opposé. L’élimination réussie des bulles d’air entraîne une diminution faible mais notable du volume dans l’autre puits. Le tableau 1 répertorie les erreurs courantes et la façon de les dépanner.
L’absence d’une pompe est une limitation lorsque l’imagerie continue est nécessaire, car la plate-forme de bascule limite l’utilisateur à l’image à intervalles de temps séquentiels. En outre, la perfusion du milieu dans cette plate-forme se compose d’écoulement bidirectionnel avec de faibles niveaux de stress de cisaillement, tandis que la vascularisation in vivo est exposée à un flux unidirectionnel avec des niveaux plus élevés de stress de cisaillement. Bien que nous n’observions pas les effets négatifs du flux bidirectionnel en ce qui concerne la germination angiogénique, le flux est un stimulus biomécanique important et de préférence contrôlé. Cependant, bien qu’il existe des configurations de pompe disponibles dans le commerce, l’interfaçage avec la plaque de 384 puits reste difficile et les configurations de la pompe entravent gravement l’évolutivité de cet assay.
La possibilité d’utiliser les iPSC-EC pour étudier la germination angiogénique ouvre de nouvelles possibilités dans la modélisation des maladies et la recherche sur les médicaments. Contrairement aux EC primaires, ces cellules peuvent être générées en quantités presque illimitées avec un génotype stable et en utilisant des techniques d’édition du génome, les cellules peuvent être générées que, y compris les kogènes et knock-ins. Cependant, comme les protocoles visant à différencier les CE de l’iPSC sont relativement nouveaux, on ne sait toujours pas ce qui conduit à des cPE-EC qui reflètent le mieux les CE primaires et quels sous-types d’EC sont ou peuvent être générés. En outre, il reste encore des questions concernant leur pertinence. Par exemple, les iPSC-EC présentent-ils encore la plasticité typique des cellules endothéliales? Et dans quelle mesure les cellules dérivées de l’iPSC réagissent-elles et interagissent-elles avec leur microenvironnement cellulaire? La plate-forme standardisée présentée ici pourrait être utilisée pour répondre à certaines de ces questions afin de valider davantage l’utilisation in vitro des EC dérivés de l’iPSC.
La direction future la plus directe pour cet avertissement sera l’intégration d’autres types de cellules qui jouent un rôle important pendant l’angiogenèse, tels que les péricytes et les macrophages. Cela facilitera la capacité d’étudier le rôle des macrophages pendant l’anastomose entre les germes ou l’adhérence des péritytes après la formation capillaire. En outre, il est possible de culture de divers autres types de cellules à l’intérieur ou contre une matrice extracellulaire (par exemple, nous avons montré la culture des neurones et diverses structures épithéliales telles que les tubules proximal et les intestins grêles), qui peuvent être combinés avec le vasculaire lits générés à l’aide de cette méthode. Enfin, il sera intéressant d’étudier la germination angiogénique dans les hydrogels synthétiques, car leur composition définie augmente encore la normalisation de l’analyse et permet l’accord agede de la rigidité et des motifs contraignants qui affectent les interactions cellule-matrice.
En conclusion, cette méthode montre la faisabilité des EC dérivés de l’iPSC dans un analyse angiogénique 3D standardisée et évolutive qui combine les conditions physiologiques pertinentes de la culture dans une plate-forme qui a la robustesse et l’évolutivité requises pour être intégrée s’intégrer dans l’infrastructure de dépistage des drogues.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux sont en partie soutenus par une subvention de recherche du programme « Meer Kennis met Minder Dieren » (projet numéro 114022501) de l’Organisation néerlandaise pour la recherche et le développement de la santé (ZonMw) et de la subvention du consortium CVON de la Fondation néerlandaise du cœur Reconnecter.
0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
Basal culture medium | NCardia | ||
Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
dPBS | Gibco | 14190-094 | |
Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
HBSS | Gibco | 14025-050 | |
Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |