Beredning av Mouse retinal Cryo-sektioner för immunhistokemi

Summary

Denna rapport beskriver omfattande metoder för beredning av frysta musens näthinnan sektioner för immunhistokemi (IHC). Metoder som beskrivs inkluderar dissektion av okulär bakre kopp, paraformaldehyd fixering, inbäddning i optimal skär temperatur (ULT) media och vävnads orientering, snittning och immunofärgning.

Abstract

Beredning av högkvalitativa mus ögat sektioner för immunhistokemi (IHC) är avgörande för att bedöma näthinnans struktur och funktion och för att fastställa mekanismerna bakom retinala sjukdomar. Upprätthålla strukturell integritet hela vävnads beredningen är avgörande för att få reproducerbara retinal IHC data men kan vara utmanande på grund av bräcklighet och komplexitet retinal cytoarchitecture. Starka fixativ som 10% formalin eller Bouin lösning optimalt bevara näthinnans struktur, de ofta hämma IHC analys genom att förbättra bakgrunden fluorescens och/eller minskande anti kroppar-epitop interaktioner, en process som kallas epitop maskering. Mildare fixativ, å andra sidan, som 4% paraformaldehyd, minskar bakgrundsfluorescens och Epitope-maskering, noggrann dissektion tekniker måste användas för att bevara näthinnans struktur. I denna artikel presenterar vi en omfattande metod för att förbereda mus okulär bakre koppar för IHC som är tillräcklig för att bevara de flesta anti kroppar-epitop interaktioner utan förlust av näthinnans strukturella integritet. Vi inkluderar representativa IHC med anti kroppar mot olika retinal cell typ markörer för att illustrera vävnads bevarande och orientering under optimala och suboptimala förhållanden. Vårt mål är att optimera IHC studier av näthinnan genom att tillhandahålla ett komplett protokoll från okulär bakre kopp dissektion till IHC.

Introduction

Immunhistokemi (IHC) är en kraftfull teknik för lokalisering av specifika proteiner och cellulära strukturer i vävnader på situ^1,2,3. Olämpliga fixeringsmetoder och suboptimala snittning av komplexa vävnader kan störa vävnads strukturen, generera hög bakgrunds färgning eller minska antikroppskoncentrationen, vilket resulterar i infärgning artefakter och därav felaktig tolkning av IHC-data⁴. Eftersom ryggradsdjur näthinnan är en komplex och mycket organiserad neurala organ som består av skikt av sammankopplade foto receptorer, interneuroner och ganglion celler, det är mycket bräcklig och kan lätt störas under dissektion och snittning. En detaljerad, standardiserad, och validerade protokoll från mus öga dissektion och orientering till immunofärgning kommer att bidra avsevärt minska IHC artefakter, därmed öka tillförlitligheten av resultaten och möjliggör mer exakta jämför ande data Analys.

Det finns många protokoll för vävnads beredning för IHC, emellertid, inte alla är lämpliga för näthinne vävnad. Starka fixativ som 10% formalin eller Bouin lösning bevara näthinnans struktur under dissektion och snittning⁵. Tyvärr, starka fixativ leder ofta till den förbättrade bakgrunden fluorescens och epitop maskering på grund av kemisk modifiering av epitoper⁶. Å andra sidan, mildare fixativ, som 4% paraformaldehyd (PFA) kan lindra några av dessa artefakter men kräver noggrann dissektion och snittning för att bevara den optimala näthinnans struktur. PFA penetrerar snabbt vävnad, men tvär länkar proteiner mycket långsamt, vilket minskar risken för epitop maskering. Eftersom kort tid PFA inkubation är en relativt mild fixering, vävnader kräver ofta snabb frysning för att bevara antigener. Det är viktigt att undvika is kristall formation under vävnads frysning eftersom de snedvrider och skadar integriteten hos celler och vävnader⁷.

Här beskriver vi detaljerade och standardiserade protokoll för dissektion, fixering, och Cryo-skydd av mus okulär bakre koppar som ger konsekventa och pålitliga IHC-data.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i de nationella hälso-och sjukvårds instituten för skötsel och användning av försöks djur som tillhandahölls av Institutet för laboratorie djurs resurser och godkändes av Institutionell djur vård och användning kommittén vid University of Pennsylvania. Alla verktyg och all utrustning för metoderna visas i figur 1 och listas i material tabellen…

Representative Results

För att illustrera hur dessa protokoll, säkerställa optimal näthinne bevarande för IHC, vi probed retinal sektioner från P28 WT möss (C57BL/6N) med anti kroppar mot rhodopsin (en foto receptor markör)8, glutaminsyra dekarboxylas 65 (Gad65, en amakrina cell markör)9, glutaminsynthetas (GS, en Müller-cellmarkör)10, och calbindin (en horisontell cell markör)11 (fig…

Discussion

Mus näthinnan dissektion är en delikat process på grund av den lilla storleken och formen av mus ögon och bräcklighet av näthinnans vävnad. Även om att utföra hög kvalitet dissektion är en fråga om praxis, med ett detaljerat protokoll, som ger effektiva metoder och tips är en nödvändighet för att få retinala avsnitt och IHC. Förutom de protokoll som beskrivs här, det finns flera tips som möjliggör konsekvent högkvalitativa retinala sektioner som är lämpliga för reproducerbara IHC.

<p class="j…

Materials

6qt. Stainless Steel Beaker (185 x 218mm)	Gilson	#MA-48	For liquid nitrogen (Figure 1E)
Aluminum foil
Cauterizer	Bovie	#AA01	To mark eye orientation (Figure 1A)
Curved forceps, Dumont #5/45 tweezers, 45-degrees bent	Electron Microscopy Sciences	#72703-D	For mouse eye enucleation and maintenance (Figure 1A)
Curved scissors, Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	#15002-08	To circumferentially cut the cornea (Figure 1B)
Dental wax-coated 35mm dissection dish			For eye cup dissection (Figure 1C)
Dissecting microscope	Leica, Houston, USA	MZ12.5 High-performance stereomicroscope
Micro Knives – Plastic Handle	Fine Science Tools	#10315-12	To make a small incision at the burn mark (Figure 1A)
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	#72660	For coating dissection dish
Slide Rack and Coverplate	Ted Pella	#36107	For retinal IHC (Figure 1G)
Stainless Steel Beaker (89 x 114mm)	Gilson	#MA-40	For isopentane bath (Figure 1E)
Styrofoam box			For insulated cooler
Thin forceps Dumont #5	Fine Science Tools	#11254-20	To remove the cornea and extract the lens (Figure 1B)
Tissue-Tek cryomold  (10mm x 10mm x 5mm)	Electron Miscroscopy Sciences	#62534-10	Mold for OCT embedding
Buffers and Reagents	Company	Catalog Number	Comments
Blocking solution			2% Normal Horse Serum, 1.5% Cold Fish skin Gelatin (at 40-50% in H2O, cat #G7765), 5% bovine serum albumin (cat #AK1391-0100) in permeabilization buffer.
Gelvatol (anti-fading mounting media)			Under the fume hood, dissolve 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) in 10mL Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  Adjust to pH 8-8.5 with 12N HCl (~ 5 drops).  Store in amber drop bottle at 4°C  (8).
Hoechst 33342 1000x Stock	Thermo Scientific	#62249	1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquot and store in dark, at 4°C for up to 1 year or at -20°C for long term storage. Prepare fresh  at 1 ug/mL (1x)
Isopentane, 99%	GFS Chemicals	#2961
Liquid Nitrogen
Paraformaldehyde (PFA) in PBS	Electron Microscopy Sciences	#15710	Prepared fresh 4% PFA from 16% PFA stock. Store the remaining 16% PFA at 4°C in the dark.
Permeabilization solution			PBS + 0.25% Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0.05% NaN3.  Prepare fresh.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Bioworld	#41620015-20	0.02 g/L KCl, 0.02 g/L KH2PO4, 0.8 g/L NaCl, 0.216 g/L Na2HPO4 , pH 7.4.  Prepared from 10x stock
Sucrose solutions	Fisher Scientific	#S-5-500	Dissolve the appropriate amount of sucrose in  37°C PBS (takes ~15 min to dissolve). May be stored for a few days at 4°C.
Tissue-Tek OCT-compound	Sakura	#4583
Antibodies	Company	Catalog Number	Comments
anti-calbindin	Sigma-Aldrich	C8666	To label horinzotal cells
anti-GAD65	Chemicon	AB5082	To label GABAergic amacrine cells
anti-GS	BD Transduction	610517	To label Müller cells
anti-rhodopsin	Millipore	MAB5316	To label rods