Protokollen præsenterer omprogrammering af mononukleære celler i perifert blod for at inducere neurale stamceller ved Sendai-virus infektion, differentiering af iNSCs i dopaminerge neuroner, transplantation af DA-prækursorer til den ensidigt læsionerede Parkinsons sygdom-musemodeller og evaluering af sikkerheden og effekten af iNSC-afledte DA-prækursorer til PD-behandling.
Parkinsons sygdom (PD) er forårsaget af degeneration af dopaminerge (DA) neuroner på substantia nigra pars Compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM). Celle substitutionsterapi har stor løfte om behandling af PD. for nylig er inducerede neurale stamceller (iNSCs) dukket op som en potentiel kandidat til celle substitutionsbehandling på grund af den reducerede risiko for tumordannelse og plasticiteten til at give anledning til Regionspecifikke neuroner og glia. iNSCs kan omprogrammeres fra autologt somatiske cellulære kilder, såsom fibroblaster, mononukleære celler i perifert blod (PBMNCs) og forskellige andre typer celler. Sammenlignet med andre typer af somatiske celler, PBMNCs er en tiltalende starter celletype på grund af den lethed at få adgang til og udvide i kulturen. Sendai virus (SeV), en RNA ikke-Integrativ virus, kodning omprogrammering faktorer, herunder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC, har en negativ-Sense, enkelt-strandede, ikke-segmenteret genom, der ikke integreres i Host Genome, men kun replikater i cytoplasmaet af inficerede celler, der tilbyder et effektivt og sikkert køretøj til omprogrammering. I denne undersøgelse beskriver vi en protokol, hvor iNSCs opnås ved at omprogrammere PBMNCs, og differentieret til specialiserede VM DA neuroner ved en totrins metode. Så DA prækursorer er transplanteres i ensidigt 6-hyroxydopamin (6-OHDA)-lesioned PD musemodeller til at evaluere sikkerheden og effekten for behandling af PD. Denne metode giver en platform til at undersøge de funktioner og terapeutiske virkninger af patientspecifikke DA neurale celler in vitro og in vivo.
Parkinsons sygdom (PD) er en almindelig neurodegenerativ lidelse, forårsaget af degeneration af dopaminerge (DA) neuroner på substantia nigra pars Compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM), med en prævalens på mere end 1% i populationen over 60 år 1 , 2. i løbet af det seneste årti, celleterapi, der har til formål enten at erstatte de degenerative eller beskadigede celler, eller nærende mikromiljø omkring degenererede neuroner, har vist potentiale i behandling af PD3. I mellemtiden har omprogrammering teknologi gjort betydelige fremskridt4, som giver en lovende cellulære kilde til substitutionsterapi. Humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) og embryonale stamceller (ESCs) har vist sig at være i stand til at differentiere sig i DA neurale celler, som kunne overleve, modnes, og forbedre motoriske funktioner, når podet i rotte og ikke-humane primat PD modeller5 ,6,7,8. iPSCs repræsenterer en milepæl i cellulære omprogrammering teknologier og har et stort potentiale i celletransplantation; Men, der er stadig en bekymring over risikoen for tumordannelse fra ufuldstændigt differentierede celler. En alternativ cellulær kilde til celletransplantation er Lineage-forpligtede voksne stamceller opnået gennem direkte omprogrammering, såsom inducerede neurale stamceller (iNSCs), som kan udledes af de ustabile mellemprodukter, uden om pluripotens etape9,10,11.
Både ipscs og inscs kan omprogrammeres fra autologt cellulære kilder, såsom fibroblaster, mononukleære celler i perifert blod (pbmncs) og forskellige andre typer af celler12,13,14, hvilket reducerer immunogenicitet af transplanterede celler i stor grad. Desuden, sammenlignet med iPSCs, iNSCs er iboende med reduceret risiko for tumordannelse og Lineage-engageret plasticitet, kun i stand til at skelne til neuroner og glia11. I de indledende undersøgelser, humane eller mus ipscs og inscs blev genereret fra fibroblaster opnået fra hudbiopsier, som er en invasiv procedure14,15. Med denne respekt, PBMNCs er en tiltalende starter celle kilde på grund af den mindre invasive prøvetagning proces, og den lethed at opnå et stort antal celler inden for en kort periode med ekspansion tid16. Indledende omprogrammering undersøgelser ansat Integrative levering systemer, såsom lentiviral eller antiretroviral vektorer, som er effektive og nemme at implementere i mange typer af celler17; disse leveringssystemer kan dog forårsage mutationer og reaktivering af rest transgener, som frembyder sikkerhedsproblemer til kliniske terapeutiske formål12. Sendai virus (SeV) er en ikke-Integrativ RNA-virus med en negativ fornuft, enkelt-strandede genom, der ikke integreres i Host genom, men kun replikater i cytoplasmaet af inficerede celler, tilbyder et effektivt og sikkert køretøj til omprogrammering18 ,19. Rekombinant SeV vektorer er tilgængelige, der indeholder omprogrammering faktorer, herunder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC i deres åbne læse rammer. Desuden kan de virale vektorer forbedres yderligere ved at indføre temperaturfølsomme mutationer, så de hurtigt kan fjernes, når dyrknings temperaturen hæves til 39 °C20. I denne artikel beskriver vi en protokol til at omprogrammere PBMNCs til iNSCs ved hjælp af SeV-systemet.
Mange undersøgelser har rapporteret afberegning af da neuroner fra humane esc’er eller ipscs ved hjælp af forskellige metoder6,8,21. Der er imidlertid mangel på protokoller, som beskriver differentieringen af DA-neuroner fra iNSCs i detaljer. I denne protokol vil vi beskrive den effektive generation af DA neuroner fra iNSCs ved hjælp af en to-trins metode. DA neuronal prækursorer kan transplanteres i striatum af PD musemodeller for sikkerhed og effektivitet evalueringer. Denne artikel vil præsentere en detaljeret protokol, der dækker forskellige stadier fra generation af induceret neurale stamceller af Sendai virus, differentiering af iNSCs ind i DA neuroner, etablering af mus PD modeller, til transplantation af DA prækursorer i striatum af PD-modellerne. Ved hjælp af denne protokol kan man generere iNSCs fra patienter og raske donorer og udlede DA neuroner, der er sikre, standardiserbare, skalerbare og homogene til celletransplantation formål, eller til modellering PD i en skål og undersøgelse af mekanismerne underliggende sygdomsudbrud og-udvikling.
Her præsenterede vi en protokol, der dækkede forskellige stadier af iNSC-DA celleterapi for PD-modeller. Kritiske aspekter af denne protokol omfatter: (1) isolering og udvidelse af Pbmn’er og omprogrammering af Pbmn’er til iNSCs ved en infektion, (2) differentiering af iNSCs til DA neuroner, (3) etablering af ensidige 6-OHDA-lesioned PD-musemodeller og adfærdsmæssige vurdering og (4) celletransplantation af DA-prækursorer og adfærds vurdering.
I denne protokol omfatter den første del in…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev støttet af følgende tilskud: stamcelle og Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation i Kina (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), støtteprojekt af højt niveau lærere i Beijing kommunale universiteter i perioden 13:5-årige plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical system højt niveau talent Award (2015-3-063), Beijing Kommunale sundhed provision fond (PXM 2018_026283_000002), Beijing 100, tusind, og 10000 talenter Fund (2018A03), Beijing kommunale administration af hospitaler klinisk medicin udvikling af særlig støtte (ZYLX201706), og Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).
15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
24-well plate | Corning | 3337 | |
50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
6-well plate | Corning | 3516 | |
Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
Insulin | Roche | 12585014 | |
ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
Laminin | Roche | 11243217001 | |
Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
Sucrose | baiaoshengke | ||
TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
Trypan blue | Gibco | T10282 | |
Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |