דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות
Summary
הפרוטוקול מציג את התיכנות מראש של תאים היקפיים דם מונפקוף כדי לגרום לתאי גזע עצביים על ידי זיהום וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים הפראים, השתלת ה-DA מקדים לתוך מגירסה חד צדדית מחלת פרקינסון מודלים העכבר, והערכה של הבטיחות והיעילות של הקדם-הלאומית של התובע המחוזי עבור טיפול PD.
Abstract
מחלת פרקינסון (PD) נגרמת על ידי התנוונות של הנוירונים הדוגיים (DA) של הספסטיה הכושי pars (SNpc) ב mesencephalon הגחוני (VM). טיפול החלפת תאים מבטיח הבטחה גדולה לטיפול במשטרה. לאחרונה, המושרה תאי גזע עצביים (iNSCs) התפתחה כמועמד פוטנציאלי לטיפול החלפת תאים בשל הסיכון מופחת של היווצרות הגידול הפלסטיות כדי להצמיח אזור מסוים נוירונים ו גליה. iNSCs ניתן לתכנתו ממקורות סלולריים באופן אוטוולוגי, כגון פיברותקיעות, תאי דם היקפיים (PBMNCs) וסוגים שונים של תאים. בהשוואה לסוגים אחרים של תאים סומטיים, PBMNCs הם סוג של תא starter מושך בשל הקלות לגישה ולהתרחב בתרבות. וירוס סנדאי (צב), וירוס RNA non-אינטגרטיבי, קידוד גורמים מתכנות כולל האדם OCT3/4, SOX2, KLF4 ו c-myc, יש הגיון שלילי, יחיד תקועים, הגנום הלא מקוטע שאינו משתלב לתוך גנום מארח, אבל רק משכפל את הציטופלסמה של תאים נגועים, המציע רכב יעיל ובטוח לתיכנות מראש. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול שבו iNSCs מתקבלים על ידי מתיכנות מחודש PBMNCs, והבדיל לתוך הנוירונים מיוחדים VM DA על ידי שיטה דו-שלבית. ואז DA-סמנים מושתלים לתוך באופן חד-צדדי 6-הידרודופאמין (6-OHDA)-לגירסה מודלים עכבר המשטרה כדי להעריך את הבטיחות והיעילות לטיפול במשטרה. שיטה זו מספקת פלטפורמה לחקור את הפונקציות וההשפעות הטיפוליות של תאי העצבים הספציפיים של החולה, בתוך מבחנה ובvivo.
Introduction
מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה ניווניות הנפוצה, הנגרמת על ידי ניוון של דואמנרכולינרגיות (DA) נוירונים ב-compacta הכושי pars (SNpc) בבית mesencephalon (VM), עם שכיחות של יותר מ 1% באוכלוסיה על 60 שנים של גיל מיכל בן , 2. בעשור האחרון, טיפול בתאים, מכוון או מחליף את התאים ניווניות או פגומים, או הזנה מיקרואקולוגיה סביב הנוירונים המתנוונת, הראו פוטנציאל לטיפול של PD3. בינתיים, טכנולוגיה התיכנות מחודש עשה התקדמות משמעותית4, אשר מספק מקור הסלולר מבטיח טיפול חלופי. האדם המושרה pluripotent תאי גזע (iPSCs) ותאי גזע עובריים (ESCs) הוכחו להיות מסוגלים להבדיל לתאי העצבים של DA, אשר יכול לשרוד, מורעד, ולשפר את הפונקציות מנוע כאשר מושתל לתוך החולדה ומודלים שאינם אנושיים משטרת הפרימטים5 ,6,7,8. iPSCs מייצגים אבן דרך בטכנולוגיות תכנות הסלולר יש פוטנציאל גדול השתלת תא; עם זאת, יש עדיין חשש לגבי הסיכון של היווצרות הגידול מן התאים הבדיל לחלוטין. מקור הסלולר חלופה עבור השתלת תא היא השושלת מחויבת תאי גזע מבוגרים שהתקבלו באמצעות תכנות ישיר, כגון תאי גזע עצביים המושרה (iNSCs), אשר ניתן נגזר מintermediates לא יציב, עוקף את pluripotency . שלב9,10,11
ניתן לiPSCs גם ממקורות סלולריים באופן אוטוולוגי, כגון פיברותקיעות, תאי דם היקפיים (pbmncs) וסוגים שונים של תאים12,13,14, ובכך להקטין את ה חיסוני של תאים מושתלים במידה רבה. יתר על כן, לעומת iPSCs, iNSCs הם הטבועה בסיכון של היווצרות הגידול השושלת מחויבת פלסטיות, רק מסוגל להבדיל לנוירונים ו glia11. במחקרים הראשוניים, האדם או העכבר iPSCs ו iNSCs נוצרו מפיברופיצוצים שהתקבלו ביופסיה העור, שהוא הליך פולשני14,15. עם כבוד זה, PBMNCs הם מקור מושך התא המתנע בגלל תהליך הדגימה פחות פולשנית, ואת הקלות להשיג מספר גדול של תאים בתוך תקופה קצרה של זמן ההרחבה16. מחקרים ראשוניים התחלתיים מועסקים מערכות מסירה אינטגרטיבית, כגון וקטורים לנטינגיי או retroviral יעיל, אשר יעילים וקל ליישם בסוגים רבים של תאים17; עם זאת, מערכות משלוח אלה עלול לגרום מוטציות וההפעלה מראש של שיורית טרנסגנים, אשר מציגים בעיות בטיחות למטרות טיפוליות קליני12. וירוס סנדאי (צב) הוא וירוס בלתי אינטגרטיבי RNA עם תחושה שלילית, יחיד תקוע הגנום שאינו משתלב לתוך הגנום המארח, אבל רק משכפל את הציטופלסמה של תאים נגועים, המציע רכב יעיל ובטוח עבור תכנות מחודש18 ,19. וקטורים רקומביננטי צב זמינים המכילים גורמים הניתנים לתיכנות כולל האדם OCT3/4, SOX2, KLF4 ו -c-myc במסגרות הקריאה פתוח שלהם. בנוסף, ניתן לשפר היתר וקטורים ויראליים על-ידי החדרת מוטציות רגישות לטמפרטורה, כך שניתן יהיה להסירו במהירות כאשר טמפרטורת התרבות מורמת ל-39 ° c20. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול כדי לתכנת מיתכנת PBMNCs לiNSCs באמצעות מערכת צב.
מחקרים רבים דיווחו על הנגזרת של הנוירונים DA של האדם escs או iPSCs באמצעות שיטות שונות6,8,21. עם זאת, יש מחסור של פרוטוקולים המתארים את הבידול של הנוירונים DA מ iNSCs בפרטים. בפרוטוקול זה, נתאר את הדור היעיל של נוירונים DA מ iNSCs באמצעות שיטה דו-שלבית. הסמנים העצביים של DA יכולים להיות מושתלים לתוך הסטריאטום של מודלים של עכבר PD עבור הערכות בטיחות ויעילות. מאמר זה יציג פרוטוקול מפורט המכסה שלבים שונים מדור של תאי גזע עצביים המושרה על ידי וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים DA, הקמת מודלים של משטרת העכבר, להשתלה של הקדם-סמנים של DA לתוך הסטריאטום של דגמי המשטרה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן ליצור iNSCs מפני חולים ותורמים בריאים ולהפיק הנוירונים DA כי הם בטוחים, standardizable, מדרגי והומוגנית עבור מטרות השתלת תאים, או עבור מידול המשטרה בצלחת וחקירה של המנגנונים התפתחות המחלה הבסיסית ופיתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן הצגנו פרוטוקול שכיסה בשלבים שונים של טיפול בתאי iNSC-DA עבור דגמי PD. היבטים קריטיים של פרוטוקול זה כוללים: (1) בידוד והתרחבות של PBMNCs ותכנות משנה של PBMNCs לתוך iNSCs על-ידי זיהום צב, (2) הבחנה של iNSCs כדי הנוירונים DA, (3) הקמתה של 6-OHDA-לישה מודל העכבר מודלים התנהגותיים הערכה, ו (4) השתלת תאים של הערכה מראש …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה הייתה נתמכת על ידי המענקים הבאים: תא גזע ותרגום מפתח לאומי (2016YFA0101403), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81661130160, 81422014, 81561138004), הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג (5142005), קרן הכשרונות של בייג (2017000021223TD03), פרויקט תמיכה של מורים ברמה גבוהה ב בייג האוניברסיטאות העירוניות בתקופה של חמש עשרה-שנה תוכנית (CIT & TCD20180333), בייג מערכת רפואית ברמה גבוהה פרס כישרון (2015-3-063), בייג המועצה העירונית לבריאות העירייה (pxm 2018_026283_ 000002), בייג 100, אלף, ו 10000 כשרונות קרן (2018a03), המינהל העירוני של בייג של בתי חולים לפיתוח רפואה קלינית של תמיכה במימון מיוחד (ZYLX201706), וה האגודה המלכותית-ניוטון (NA150482).
Materials
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20℃ |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβⅢ | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor βⅢ |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
Riferimenti
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson’s disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson’s Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson’s disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson’s disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
