Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Summary

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Abstract

La enfermedad de Parkinson (PD) es causada por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) en el mesencéfalo ventral (VM). La terapia de reemplazo celular tiene una gran promesa para el tratamiento de la DP. Recientemente, las células madre neurales inducidas (iNSC) han surgido como un candidato potencial para la terapia de reemplazo celular debido al menor riesgo de formación de tumores y la plasticidad para dar lugar a neuronas y glia específicas de la región. los iNSC se pueden reprogramar a partir de fuentes celulares somáticas autólogas, como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica (PMF) y varios otros tipos de células. En comparación con otros tipos de células somáticas, los PBMNAC son un tipo de celda de inicio atractivo debido a la facilidad de acceso y expansión en cultivo. El virus Sendai (SeV), un virus no integrador de ARN, que codifica factores de reprogramación como OCT3/4humano, SOX2, KLF4 y c-MYC, tiene un genoma no segmentado, de un solo cadena y de sentido negativo que no se integra en gento del huésped, pero sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas, ofreciendo un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación. En este estudio, describimos un protocolo en el que los iNSC se obtienen reprogramando PBX y diferenciados en neuronas DA de VM especializadas mediante un método de dos etapas. A continuación, los precursores de DA se trasplantan en modelos unilaterales de ratón PD de 6-hyroxydopamine (6-OHDA) para evaluar la seguridad y eficacia para el tratamiento de la DP. Este método proporciona una plataforma para investigar las funciones y efectos terapéuticos de las células neuronales DA específicas del paciente in vitro e in vivo.

Introduction

La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo común, causado por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) en el mesencéfalo ventral (VM), con una prevalencia de más del 1% en la población mayor de 60 años de edad ^{1 , 2}. Durante la última década, la terapia celular, dirigida a sustituir las células degenerativas o dañadas, o nutrir el microambiente alrededor de las neuronas degenerativas, ha demostrado potencial en el tratamiento de la DP^3. Mientras tanto, la tecnología de reprogramación ha hecho progresos significativos⁴, que proporciona una fuente celular prometedora para la terapia de reemplazo. Se ha demostrado que las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (iPSC) y las células madre embrionarias (ESC) son capaces de diferenciarse en células neuronales DA, que podrían sobrevivir, madurar y mejorar las funciones motoras cuando se injertan en modelos de DP de rata y primate no humano^{5 ,6,7,8}. los iPSC representan un hito en las tecnologías de reprogramación celular y tienen un gran potencial en el trasplante de células; sin embargo, todavía existe una preocupación sobre el riesgo de formación de tumores de las células incompletamente diferenciadas. Una fuente celular alternativa para el trasplante de células es la que las células madre adultas cometidas por linajes se obtienen a través de la reprogramación directa, como las células madre neurales inducidas (iNSC), que pueden derivarse de los intermediarios inestables, evitando la pluripotencia etapa^9,10,11.

Tanto los ISPC como los iNSC pueden reprogramarse a partir de fuentes celulares autólogas, como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) y varios otros tipos de células^12,13,14,reduciendo así la inmunogenicidad de las células trasplantadas en gran medida. Además, en comparación con los iPSC, los iNSC son inherentes a la reducción del riesgo de formación de tumores y la plasticidad comprometida con el linaje, sólo capaces de diferenciarse en neuronas y glia¹¹. En los estudios iniciales, se generaron iPSCs humanos o ratón e iNSC a partir de fibroblastos obtenidos a partir de biopsias cutáneas, que es un procedimiento invasivo^14,15. Con este respecto, los PBMNC sson una fuente de células de inicio atractiva debido al proceso de muestreo menos invasivo, y la facilidad para obtener un gran número de células dentro de un corto período de tiempo de expansión¹⁶. Los estudios iniciales de reprogramación emplearon sistemas de administración integrador, como vectores lentivirales o retrovirales, que son eficientes y fáciles de implementar en muchos tipos de células^17; sin embargo, estos sistemas de administración pueden causar mutaciones y reactivación de transgenes residuales, que presentan problemas de seguridad con fines terapéuticos clínicos^12. El virus DeSendai (SeV) es un virus de ARN no integrador con un genoma de una sola cadena de sentido negativo que no se integra en el genoma del huésped, sino que sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas, ofreciendo un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación^{18 ,19}. Hay disponibles vectores SeV recombinantes que contienen factores de reprogramación, incluidos los modelos humanos OCT3/4, SOX2, KLF4 y c-MYC en sus marcos de lectura abiertos. Además, los vectores virales SeV pueden mejorarse aún más mediante la introducción de mutaciones sensibles a la temperatura, de modo que podrían eliminarse rápidamente cuando la temperatura de cultivo se eleva a 39 oC²⁰. En este artículo, se describe un protocolo para reprogramar PBX a iNSCs mediante el sistema SeV.

Muchos estudios han reportado derivación de neuronas DA de ESCs humanas o iPSC utilizando varios métodos^6,8,21. Sin embargo, hay una escasez de protocolos que describen la diferenciación de las neuronas DA de iNSCs en detalle. En este protocolo, describiremos la generación eficiente de neuronas DA a partir de iNSCs utilizando un método de dos etapas. Los precursores neuronales DA se pueden trasplantar al estriado de los modelos de ratón PD para evaluaciones de seguridad y eficacia. Este artículo presentará un protocolo detallado que cubre varias etapas desde la generación de células madre neurales inducidas por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas DA, establecimiento de modelos de PD de ratón, al trasplante de precursores de DA en el estriado de los modelos de PD. Usando este protocolo, uno puede generar iNSCs de pacientes y donantes sanos y derivar neuronas DA que sean seguras, estandarizadas, escalables y homogéneas para fines de trasplante celular, o para modelar PD en un plato e investigar los mecanismos enfermedad subyacente y desarrollo.

Protocol

Todos los procedimientos deben seguir las directrices del comité institucional de ética de la investigación humana. El consentimiento informado debe obtenerse de pacientes o voluntarios sanos antes de la recolección de sangre. Este protocolo fue aprobado por el comité de ética de la investigación humana de la institución y se realizó de acuerdo con las directrices de la institución para el cuidado y uso de animales. 1. Recogida, aislamiento y expansión de los PBMN …

Representative Results

Aquí, informamos de un protocolo que cubre diferentes etapas de la terapia celular iNSC-DA para tratar modelos de DP. En primer lugar, los PBMNAC fueron aislados y ampliados, y reprogramados en iNSCs por infección por SeV. En la Figura 1se muestra una representación esquemática de los procedimientos con expansión PBMNC e inducción de iNSC. El día -14, los PBMNAC se aislaron utilizando un medio de gradiente de densidad (Tablade materiales). Antes de la centrifugación,…

Discussion

Aquí presentamos un protocolo que cubrió diferentes etapas de la terapia celular iNSC-DA para modelos de DP. Los aspectos críticos de este protocolo incluyen: (1) aislamiento y expansión de PBMNCs y reprogramación de PBMNCs en iNSCs por infección SeV, (2) diferenciación de iNSCs a las neuronas DA, (3) establecimiento de modelos unilaterales de ratón PD 6-OHDA-lesioned y comportamiento evaluación, y (4) trasplante de células de precursores de la DA y evaluación del comportamiento.

En…

Materials

15-ml conical tube	Corning	430052
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate	Corning	3337
50-ml conical tube	Corning	430828
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381
6-well plate	Corning	3516
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Cell dissociation reagent
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A92902	Toxic with skin contact
B27 supplement	Invitrogen	17504044
BDNF	Peprotech	450-02	Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin	BD	367871
BSA	yisheng	36106es60	Fetal bovine serum
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2	ZENOAQ	100ml	Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate	Invitrogen	11905031
CHIR99021	Gene Operation	04-0004
Coverslip	Fisher	25*25-2
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417-10mg
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
DMEM-F12	Gibco	11330
DMEM-F12	Gibco	11320
Donkey serum	Jackson	017-000-121
EPO	Peprotech	100-64-50UG	Human Erythropoietin
FGF8b	Peprotech	100-25
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	P=1.077, density gradient medium
GDNF	Peprotech	450-10	Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12	Gibco	11765-054
HBSS	Invitrogen	14175079	Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor	Millpore	LIF1010
Human recombinant SCF	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	Human insulin-like growth factor
IL-3	Peprotech	200-03-10UG	Human interleukin 3
IMDM	Gibco	215056-023	Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	51500-056	Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement	Gibco	10828028	Serum free basal medium
Laminin	Roche	11243217001
Microsyringe	Hamilton	7653-01
N2 supplement	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	Non-essential amino acid
Neurobasal	Gibco	10888	Basic medium
PDL	Sigma-Aldrich	P7280	Poly-D-lysine
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Gene Operation	04-0010-10mg	Store from light at -20℃
Sendai virus	Life Technologies	MAN0009378
Sucrose	baiaoshengke
TGFβⅢ	Peprotech	100-36E	Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin	R&D Systems	2914-HT-100G
Triton X 100	baiaoshengke		Nonionic surfactant
Trypan blue	Gibco	T10282
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126