اعداد انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة للتحليل البنيوي الهيكلي للتوزيع الحويصلة المتشابكة في المحطات العصبية
Summary
ونحن وصف إجراءات لمعالجه انسجه المخ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الدقة لتحليل مورفرومتري من توزيع الحويصلات متشابك في المحطات العصبية. الرسوم البيانية التي تم الحصول عليها مع هذه الأساليب يمكن أيضا ان تستخدم لدراسة المورفولوجية لعدد من المكونات الخلوية الأخرى وعلاقتاتها الهيكلية الابعاد.
Abstract
وقد استغل مختبرنا وغيرها الكثير من قوه حل عاليه من انتقال المجهر الكترون لدراسة المورفولوجية والتنظيم المكاني من الحويصلات متشابك. من أجل الحصول علي الرسوم البيانية الكترون عاليه الجودة التي يمكن ان تسفر عن درجه من التفاصيل المورفولوجية اللازمة للتحليل الكمي للتوزيع قبل متشابك الحويصلة ، اعداد العينة الأمثل أمر بالغ الاهميه. التثبيت الكيميائي هو الخطوة الاولي في عمليه اعداد العينات ، وذات اهميه قصوى للحفاظ علي البنية الدقيقة. تثبيت الاوعيه الدموية مع محلول الفورمالديهايد جلوتارالدهيد ، تليها معالجه العينات الذبذبات مع الاوزميوم tetroxide ، تستقر الحد الأقصى لعدد الجزيئات ، وخاصه البروتينات والدهون ، والنتائج في الحفظ المتفوق من البنية الفوقية. ثم تتم معالجه الانسجه مع المضادة للتلوين ، والجفاف متسلسلة والراتنج التضمين. ان تلطيخ كتله مع خلات اليورانيل (اي ، تلطيخ الانسجه الذبذبات الداخلية قبل التضمين الراتنج) يعزز التباين الذاتية وتستقر مكونات الخلية ضد الاستخراج اثناء معالجه العينات. ويمكن زيادة التباين من خلال تطبيق خلات اليورانيل كوصمه عار علي أقسام سامسونج. المزدوج تلطيخ المقاطع سامسونج مع سترات الرصاص بعد العلاج خلات اليورانيل يحسن أيضا دقه الصورة ، من خلال تكثيف الكترون التعتيم من الهياكل التي تحتوي علي حمض نووي من خلال ملزمه انتقائية من الرصاص إلى خلات اليورانيل. المجهر الكترون الإرسال هو أداه قويه لتوصيف التفاصيل المورفولوجية من الحويصلات متشابك والتقدير الكمي من حجمها والتنظيم المكاني في محطه بوتون. ومع ذلك ، لأنه يستخدم الانسجه الثابتة ، ونقل المجهر الكترون لا يمكن الا ان توفر معلومات غير مباشره فيما يتعلق بالحياة أو العمليات المتطورة. ولذلك ، ينبغي النظر في التقنيات الأخرى عندما يكون الهدف الرئيسي هو دراسة الجوانب الديناميكية أو الوظيفية لعمليات الاتجار بالحويصلات المتشابكة وندره المحببات.
Introduction
ونحن وصف أساليب لاعداد انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة للحصول علي الكترونات عاليه الجودة المجهرية للتحليل في العمق مورفمتري من التوزيع المكاني فيجليد متشابك في المحطات العصبية1،2. ويمكن أيضا استخدام الرسومات المجهرية عاليه التباين التي يمكن الحصول عليها من خلال معالجه العينات بعد هذه الطرق لدراسة المورفولوجية التفصيلية لعدد من المكونات الخلوية وعلاقتاتها الهيكلية الابعاد3,4.
المجهر الكترون الإرسال (TEM) هو أداه قويه لدراسة المورفولوجية من العضيات وغيرها من الهياكل الخلوية كميا. اعتبارا من هذا العقد ، لا توجد طرق أخرى للتحقيق التي يمكن ان توفر نفس الدرجة من القرار من الاغشيه الدهنية والعضوية بدون وضع العلامات المناعية ، باستثناء كريوفيكسيشن بالضغط العالي التجميد. ومع ذلك ، لا تستخدم تقنيات استبدال التجميد علي نطاق واسع ، وتتطلب عاده معدات باهظه الثمن وأوقات اعداد طويلة.
من أجل الاستفادة من قوه الحل العالية لل TEM ، يعد الاعداد الأمثل للعينه أمرا بالغ الاهميه. الأهداف الرئيسية لاعداد العينات هي الحفاظ علي بنيه الانسجه مع الحد الأدنى من التغيير من الدولة الحية ، وتعزيز النقيض من العينة ، واستقرار الانسجه ضد استخراج المكونات الخلوية اثناء المعالجة والتعرض للكترون شعاع. وقد أدخلت العديد من البروتوكولات لاعداد الانسجه TEM والكمال من قبل العديد من المختبرات علي مر السنتين. وقد ركزت العديد منهم علي أساليب التصور الأمثل من الحويصلات متشابك5,6,7,8,9,10,11. من بين عدد من الأساليب الراسخة ، والذهب القياسية المستخدمة حاليا ، اخترنا إجراءات لتثبيت الكيميائية ، وتثبيت وظيفة ، وتلطيخ كتله ، والجفاف متسلسلة ، وتضمين الراتنج واخر تلطيخ التي تهدف إلى الحفاظ علي هيكل الانسجه الأمثل تحقيق التباين صوره ممتازة. من الملاحظة ، يمكن ان يكون الحفاظ علي البنية الدقيقة صعبا بشكل خاص عند العمل مع انسجه المخ الفئران حديثي الولادة. في الواقع ، يتميز الجهاز العصبي المركزي للحيوانات الصغيرة جدا بمحتوي المياه اعلي من الدماغ الكبار ، وتوسيع أكثر بروزا من المساحات خارج الخلية ، والاتصالات أكثر مرونة بين الخلايا12. وهذا يجعل انسجه الدماغ الفئران حديثي الولادة حساسة للغاية للتغيرات في osmolarity ، وعرضه بشكل رائع لانكماش الارتيقيه و/أو تورم عند معالجتها من خلال حلول متسلسلة من قوه انقباض مختلفه12. ولذلك ، استخدمت أساليبنا الحلول لمعالجه العينات التي هي من الاسموليه أقرب ما يمكن إلى ان من الفئران الوليد الدماغ. وكان هدفنا الحصول علي صور عاليه الجودة وعاليه الدقة المجهر الكتروني للتقييم الكمي للتوزيع المكاني لحويصلات متشابك في المحطات العصبية. علي وجه التحديد ، سعينا لقياس عدد الحويصلات داخل المحطة العصبية ، والمسافة من الحويصلات متشابك من غشاء البلازما قبل متشابك ، وعدد من الحويصلات رست في الغشاء قبل متشابك ، وحجم الحويصلات متشابك المسافات بين الحويصلات1.
التثبيت الكيميائي المرضي هو شرط أساسي للحصول علي الرسوم المجهرية الكترون عاليه الجودة التي يمكن ان توفر التفاصيل المورفولوجية اللازمة لدراسة التشكل الحويصلة المتشابكة والتنظيم المكاني. علي الرغم من وجود عده طرق للتثبيت, تثبيت انسجه المخ عن طريق التروية الوعائية هو بالتاكيد متفوقة علي أساليب أخرى. منذ التثبيت عن طريق التروية الوعائية يبدا مباشره بعد إلقاء القبض علي الدورة الدموية الجهازية ، فانه يقصر الفاصل الزمني بين الاكسده من انسجه المخ وعبر ربط البروتينات مع المثبتات ، مما ادي إلى الحد الأدنى من التعديلات في الخلية هيكل. وعلاوة علي ذلك ، فانه يحقق اختراق سريع وموحد ، وذلك بسبب التدفق السريع من المثبت من سرير الاوعيه الدموية إلى المقصورات خارج الخلية والخلوية12،13،14. التثبيت الاولي مع غلوتارالديهيد ، تليها التثبيت الثانوي (بعد التثبيت) مع الاوزميوم tetroxide ، غله ممتازة الحفاظ علي هيكل غرامه15،16،17. مزيج من غلوتارالديهيد وبارافورمالدهيد لديه ميزه اضافيه لاختراق أكثر سرعه في الانسجه12.
نظرا لان الانسجه البيولوجية ليست جامده بما فيه الكفاية ليتم قطعها إلى أقسام رقيقه دون دعم مصفوفة الراتنج ، فانها تحتاج إلى ان تكون جزءا لا يتجزا في وسط قبل التقطيع رقيقه. المياه-immiscible راتنجات الايبوكسي تستخدم عاده كوسيلة التضمين في TEM. عند استخدام هذا النوع من المصفوفة ، يجب استبدال جميع المياه المجانية للعينه بمذيب عضوي قبل تسلل الراتنج. يتم أزاله المياه عن طريق تمرير العينة من خلال سلسله من الحلول لتركيزات تصاعدية من الايثانول و/أو الأسيتون12. في هذا البروتوكول ، والعينات هي أول شقه جزءا لا يتجزا بين أوراق aclar مرنه ، ثم جزءا لا يتجزا في كبسوله. والنتيجة النهائية هي الانسجه التي تقع في طرف كتله الراتنج أسطواني ، والتي لديها الهندسة المثالية لتكون اقل تاثرا بالاهتزازات الناشئة خلال ميكروتومي التماس.
تلطيخ مع المعادن الثقيلة لتعزيز التباين الانسجه الذاتية هو جانب آخر مهم من اعداد العينة. ويرجع تباين الصورة في TEM إلى تشتت الكترونات بواسطة الذرات في الانسجه. ومع ذلك ، تتكون المواد البيولوجية إلى حد كبير من جزيئات منخفضه الوزن الذري (اي الكربون والهيدروجين والأكسجين والنيتروجين). ولذلك ، فان توليد تباين التشتت الكافي يتطلب دمج ذرات الوزن الذري العالية في المكونات الخلوية للانسجه. ويتحقق ذلك من خلال تلطيخ العينة مع المعادن الثقيلة12،18،19. الاوزميوم tetroxide ، واليورانيوم والرصاص ، والتي تربط بقوة للدهون ، هي المعادن الثقيلة الأكثر شيوعا المستخدمة كبقع الكترون.
الاوزميوم (الرقم الذري 76) هي واحده من المعادن الأكثر كثافة في الوجود. وهو علي حد سواء المثبت ووصمه عار, علي الرغم من ان دورها الأساسي في TEM كما هو مثبت موثوق12. من بين بروتوكولات التثبيت المختلفة في الاستخدام ، وطريقه التثبيت المزدوج مع غلوتارالديهيد تليها الاوزميوم هو الأكثر فعاليه في الحد من استخراج مكونات الخلية اثناء اعداد العينة. وتستخدم هذه المثبتات اثنين لتحقيق الاستقرار في الحد الأقصى لعدد من أنواع مختلفه من الجزيئات ، وخاصه البروتينات والدهون ، ويؤدي إلى الحفاظ علي متفوقة من الانسجه البنية العالية12،14،15، 16 , السابعة عشره
اليورانيوم (الرقم الذري 92) هو أثقل المعادن المستخدمة كبقعه الكترون ، ومعظمها عاده في شكل خلات اليورانيل. بالمثل إلى الاوزميوم, يتصرف هو بما ان وصمه عار ومثبت, رغم ان دوره أساسيه في [تيم] كوصمه عار20,21. الأحماض النووية التي تحتوي علي والهياكل غشائي ملطخه بشده وبشكل تفضيلي مع أملاح اليورانيل في الدهيد-الانسجه الثابتة22،23. علاج الانسجه مع خلات اليورانيل بعد osmication وقبل الجفاف يؤدي إلى استقرار غشائي والبني التي تحتوي علي الأحماض النووية ، فضلا عن التباين المعزز ، ويسمح بتحديد بعض التفاصيل الهيكلية التي لن يمكن الكشف عنها بسهوله في عينات ملطخه الاوزميوم وحدها12،24،25. ويعتقد ان خلات اليورانيل قد استقرار هيكل غرامه من خلال الجمع بين مع انخفاض الاوزميوم التي تم إيداعها علي اغشيه الدهون خلال osmication24. ويتحقق الحد الأقصى من التباين عندما يتم تطبيق خلات اليورانيل قبل تضمينها وباعتبارها بعد وصمه عار في المقاطع رقيقه12.
الرصاص (الرقم الذري 82) هو وصمه عار الأكثر شيوعا المستخدمة لل TEM ويستخدم أساسا لما بعد تلطيخ من أقسام رقيقه. أملاح الرصاص لديها التعتيم الكترون عاليه وإظهار تقارب لمجموعه واسعه من الهياكل الخلوية ، بما في ذلك الاغشيه والبروتينات النووية والخلوية ، والأحماض الامينيه والجليكوجين26،27. عندما يتم استخدام طريقه تلطيخ مزدوجة (اي ، تلطيخ مع خلات اليورانيل متبوعا بالعلاج مع الرصاص) ، وهذا الأخير بمثابه مطور من تلطيخ خلات اليورانيل. علي سبيل المثال ، يؤدي بعد تلطيخ الكروماتين الثابتة مع غلوتارالديهيد يزيد امتصاص اليورانيل خلات بعامل من ثلاثه28، 29،30،31،32. الرصاص يعزز أيضا تلطيخ المنقولة من المعادن الأخرى مثل الاوزميوم. ويعتقد ان الأملاح الرصاص وصمه عار الاغشيه من الانسجه الاوزميوم الثابتة عن طريق ربط للمجموعة القطبية من الفوسفاتيدات في وجود انخفاض الاوزميوم33. عيب محتمل من تلطيخ مع كل من خلات اليورانيل والرصاص ، وخاصه بالنسبة لفترات طويلة ، هو ان العديد من العناصر الهيكلية المختلفة ملطخه بالتساوي وغير علي وجه التحديد ، التالي قد لا يكون من السهل تمييزها عن بعضها البعض12 .
الإدخال الأخير لمصادر الضوء البديلة ، مثل المجهر الضوئي البصري فائق الدقة المنشط للصور ، قد تحسن بشكل كبير من دقه المجهر الضوئي34. ومع ذلك ، نظرا لان المجهر الضوئي يعتمد علي الطرق الكيميائية النسيجية والمناعية-الكيميائية لتصور البروتينات أو الانزيمات الموسومة بشكل فردي ، فان قوه TEM لعرض جميع العناصر الهيكلية في ان واحد تبقي غير مسبوقة للدراسة المتعمقة علاقات المورفولوجية والابعاد لهياكل الانسجه. علي وجه الخصوص ، لا يمكن لأي تقنيه أخرى توفير التفاصيل المورفولوجية اللازمة لاجراء تحليل مورفرومتري من توزيع الحويصلات متشابك في العصب العصبي قبل متشابك. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان الرسوم المجهرية الكترون التقاط هيكل النسيج بعد وفاه الكائن الحي ، التالي فانها لا يمكن ان توفر معلومات بشان ديناميات الاتجار بالحويصلات قبل متشابك والانتشار. التالي, أدوات أخرى, مثل التصوير الحية FM صبغ والتصحيح المشبك الكهربائية, وينبغي النظر عندما يكون الهدف الرئيسي هو دراسة الجوانب الحيوية و/أو الوظيفية من الاتجار بالحويصلات متشابك وكثرة المحببات.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعامل مع أقسام الانسجه اثناء اعداد العينات لل TEM يتطلب درجه كبيره من البراعة والتركيز والصبر. عند استخدام الماصات المجهرية لأضافه المحاليل وأزالها ، يمكن امتصاص العينات في طرف الماصة عن طريق التوتر السطحي ، لذا ينبغي توخي الحذر الشديد لتجنب تلف الانسجه بواسطة الماصة. أيضا ، خطوات معينه …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه المخطوطة من قبل المعاهد القومية للصحة/NIGMS K08 123321 (إلى N.L.) وباموال من قسم التخدير في جامعه فيرجينيا. ويود المؤلفون ان يشكروا السيد ايليف (قسم علم الاحياء ، جامعه فرجينيا ، شارلوتسفيل ، VA) علي التدريب الممتاز والمساعدة التقنية مع TEM ، وعلي انتقاداتها التي لا تقدر بثمن. ويشكر المؤلفون أيضا مرفق المجهر الكتروني المتقدم في جامعه فرجينيا للحصول علي المساعدة التقنية مع العينات والتقطيع وما بعد التلطيخ.
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
Riferimenti
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C., Santini, M. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
- Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
