Sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağıtımının Ultrastrik morfometrik analizi için yenidoğan Rat beyin dokusunun hazırlanması
Summary
Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi için yüksek çözünürlüklü elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu işleme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntemlerle elde edilen mikrografikler, diğer hücresel bileşenlerin bir dizi morfolojisi ve boyutsal yapısal ilişkilerini incelemek için de kullanılabilir.
Abstract
Laboratuvarımız ve diğerleri sinaptik veziküller Morfoloji ve mekansal organizasyonu incelemek için iletim elektron mikroskobu yüksek çözme gücü sömürüyor. Ön sinaptik vezikül dağılımının nicel analizi için gerekli olan morfolojik ayrıntı derecesini verebileceğiniz yüksek kaliteli elektron mikrografileri elde etmek için optimum numune hazırlama önemlidir. Kimyasal sabitleme, numune hazırlama sürecinde ilk adımdır ve ince ultrastrasyon korumak için son derece önemlidir. Bir glutaraldehit-formaldehit çözeltisi ile vasküler fiktasyon, ardından osmiyum tetrokid ile vibratome-kesitli numunelerin tedavisinde, moleküllerin maksimum sayısını stabilize, özellikle protein ve lipidler, ve üstün koruma sonuçları . Doku daha sonra counterstaining, sıralı dehidrasyon ve reçine katıştırma ile işlenir. Uranyl asetat ile en blok boyama (yani, reçine gömme önce vibratome-kesitli doku boyama) endojen kontrast geliştirir ve numune işleme sırasında ekstraksiyon karşı hücre bileşenlerini stabilize. Ultra ince bölümlerinde bir post-leke olarak uranyl asetat uygulayarak kontrast daha da artırılabilir. Uranyl asetat tedavisi sonrasında kurşun sitrat ile ultra ince bölümlerin çift boyama da görüntü çözünürlüğü geliştirir, nüklik asit içeren yapıların elektron-opaklık yoğunlaştırarak uranyl asetat yol seçici bağlama yoluyla. İletim Elektron Mikroskopisi sinaptik veziküller morfolojik detayları ve Terminal Bouton kendi boyutu ve mekansal organizasyon Ölçüleme için güçlü bir araçtır. Ancak, sabit doku kullandığından, iletim elektron mikroskobu sadece yaşam veya gelişen süreçler ile ilgili dolaylı bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, ana amaç sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamik veya işlevsel yönlerini incelemek için olduğunda diğer teknikler dikkate alınmalıdır.
Introduction
Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül uzamsal dağılımı derinlemesine morfometrik analizi için yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu hazırlanması için yöntemleri tarif1,2. Bu yöntemlerden sonra numuneler işlenerek elde edilebilir yüksek karşıtlık MİKROGRAFİ Ayrıca hücresel bileşenlerin bir dizi ayrıntılı Morfoloji ve boyutsal yapısal ilişkileri incelemek için kullanılabilir3,4.
İletim elektron mikroskobu (TEM) kantitatif organelleri ve diğer hücresel yapıların morfolojisi incelemek için güçlü bir araçtır. Bu on yıl itibariyle, yüksek basınçlı donma ile cryofixation hariç, immüno-etiketleme olmadan lipid membranlarının ve organelleri aynı ölçüde çözünürlük sağlayabilir başka soruşturma yöntemleri vardır. Ancak, dondurma ikame teknikleri yaygın olarak kullanılmaz ve normalde pahalı ekipman ve uzun hazırlık süreleri gerektirir.
TEM ‘in yüksek çözme gücünün avantajlarından yararlanmak için en uygun numune hazırlama işlemleri çok önemlidir. Numune preparatın ana hedefleri, yaşam durumundan minimum değişiklik ile doku yapısını korumak, numune kontrastı geliştirmek ve elektron işleme ve maruz kalma sırasında hücresel bileşenlerin çıkarılması karşı doku stabilize etmektir ışın. TEM doku hazırlığı için çok sayıda protokol, yıllarca çeşitli laboratuvarlar tarafından tanıtıldı ve mükemmelleştirilmiştir. Çoğu sinaptik veziküller5,6,7,8,9,10,11optimum görselleştirme için yöntemler üzerinde duruldu. Şu anda kullanılmakta olan bir dizi köklü, altın standart yöntem arasında, en iyi doku yapısını korumaya yönelik kimyasal fikmerasyon, sonrası fikmerasyon, özel blok boyama, sıralı dehidrasyon, reçine gömme ve sonrası boyama prosedürleri seçtik. mükemmel görüntü kontrastı elde edin. Dikkat, ince ultrastranın korunması özellikle yenidoğan sıçan beyin dokusu ile çalışırken zor olabilir. Aslında, çok genç hayvanların merkezi sinir sistemi yetişkin beyin daha yüksek bir su içeriği ile karakterize edilir, hücre dışı alanların daha belirgin genişlemesi, ve hücreler arasında daha gevşek bağlantılar12. Bu, yenidoğan sıçan beyin dokusunu Osmolarite değişikliklerine derinden hassas hale getirir ve farklı tonallık12‘ nin sıralı çözeltileri ile işlenen artifaktüel daralma ve/veya şişlik için zarif bir şekilde eğilimli olur. Bu nedenle, yöntemlerimiz, sıçan yenidoğan beynin mümkün olduğunca yakın Osmolarite olan numune işleme için çözümler istihdam. Amacımız, sinir terminallerinde sinaptik vezikül mekansal dağılımının nicel değerlendirilmesi için yüksek kalitede, yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu görüntüleri elde etmektir. Özellikle, biz sinir terminali içinde veziküllerin sayısını ölçmek için, ön sinaptik plazma membrandan sinaptik veziküllerin uzaklığı, ön sinaptik membranda yerleştirilmiş veziküllerin sayısı, sinaptik veziküller büyüklüğü ve inter-vezikül mesafeler1.
Tatmin edici kimyasal fiktasyon sinaptik vezikül Morfoloji ve mekansal organizasyon incelemek için gerekli morfolojik ayrıntı sağlayabilir yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için bir ön koşuldur. Çeşitli fikrasyon modları olmasına rağmen, vasküler perfüzyon ile beyin dokusunun fikreme yöntemi diğer yöntemlere göre çok daha üstün. Vasküler perfüzyon yoluyla fiksasyon, sistemik dolaşımın tutuklandıktan hemen sonra başladığı için, beyin dokusunun deoxygenasyonu ile proteinleri fiksasyonlarla çapraz bağlama arasındaki aralığı kısaltır ve hücrelimde asgari değişiklikler sonuçlanır Yapısı. Ayrıca, vasküler yataktan ekstraküler ve hücresel bölmeler12,13,14‘ e kadar olan fiktatif akışından dolayı hızlı ve Tekdüzen penetrasyon gerçekleştirir. , Osmiyum tetroksit ile ikincil fiktasyon (sonrası fikterasyon) ve ardından glutaraldehit ile primer fikfasyon, ince yapının mükemmel korunması sağlar15,16,17. Glutaraldehit ve paraformaldehit karışımı, dokuya daha hızlı nüfuz etmek için ek bir avantaj sunuyor12.
Biyolojik dokularda bir reçine matrisinin desteği olmadan ince bölümlere kesilecek kadar sert olmadığından, ince kesmeden önce bir ortama gömülmelidir. Su-immiscible Epoksi Reçineler genellikle TEM ‘de gömme orta olarak kullanılır. Bu tür matris kullanıldığında, tüm numunenin serbest su reçine infiltrasyon önce organik bir çözücü ile değiştirilmesi gerekir. Su, numuneyi artan etanol ve/veya aseton12konsantrasyonlarının bir dizi çözeltisiyle geçirerek kaldırılır. Bu protokolde, numuneler ilk olarak esnek aclar çarşafları arasında gömülür ve sonra bir kapsülde gömülmüştür. Nihai sonuç, Mikrotom bölümleme sırasında kaynaklanan titreşimlerden en az etkilenecek ideal geometriye sahip silindirik reçine bloğunun ucunda yer alan dokudur.
Endojen doku kontrastı geliştirmek için ağır metaller ile boyama numune hazırlama başka önemli bir yönüdür. TEM ‘de görüntü kontrastı, dokuda atomlar tarafından elektron saçılmadan kaynaklanmaktadır. Ancak, biyolojik malzemeler büyük ölçüde düşük Atomik ağırlık molekülleri (yani, karbon, hidrojen, oksijen ve azot) oluşur. Bu nedenle, yeterli saçılma kontrast nesil doku hücresel bileşenlerine yüksek Atomik ağırlık atomların eklenmesi gerektirir. Bu, ağır metaller12,18,19ile numunenin boyama yoluyla elde edilir. Lipid için güçlü bir bağ olan Osmium tetroksit, uranyum ve kurşun, elektron lekeleri olarak kullanılan en yaygın ağır metaller.
Osmium (Atom numarası 76) varoluşun en yoğun metallerden biridir. TEM ‘deki birincil rolü güvenilir bir fikreatif12olmakla birlikte, hem bir fikilatif hem de bir lekedir. Kullanımda olan çeşitli fiktasyon protokolleri arasında, numunenin hazırlanması sırasında hücre bileşenlerinin ekstraksiyonu azaltmada en etkili olan glutaraldehit ile çift fikreme yöntemi. Bu iki fiksatifler moleküllerin, özellikle protein ve lipidler farklı türde maksimum sayısını stabilize etmek için kullanılır, ve doku ultrastrture üstün korunması sonucu12,14,15, 16 , 17 yaşında.
Uranyl asetat şeklinde en yaygın elektron lekesi olarak kullanılan büyük metal (Atom numarası 92). Benzer şekilde Osmium ‘a göre, bir leke ve fikilatif olarak davranır, ancak Tem ‘deki birincil rolü bir leke olarak20,21. Nüklenli asit içeren ve membranöz yapılar aldehit-sabit dokularda uranyl tuzları ile şiddetle ve tercihen lekelenmiştir22,23. Osmikasyon sonrası uranyl asetat ile dokuların tedavisi ve dehidratasyon önce membranöz ve nüklik asit içeren yapıların stabilizasyonu, yanı sıra gelişmiş kontrast, ve izin vermez bazı yapısal detaylar tanımlaması tek başına osmiyum ile lekelenmiş numunelerde kolayca tespit edilebilir12,24,25. Uranyl asetat, osmikasyon sırasında lipid membranlarına yatırılmış olan azaltılmış osmiyum ile birleştirerek ince yapıyı stabilize edebilir düşünülmüştür24. En yüksek kontrast, uranyl asetat yerleştirilmeden önce ve ince bölümlerde12‘ de bir sonrası leke olarak uygulandığında elde edilir.
Lead (Atom numarası 82), TEM için kullanılan en sık görülen lekedir ve özellikle ince bölümlerin sonrası boyama için kullanılmaktadır. Kurşun tuzları yüksek elektron opaklığı ve membranlar, nükleer ve sitoplazmik proteinler, nükleik asitler ve glikojen dahil olmak üzere geniş bir hücre yapıları yelpazesi için benzeşimi göstermek26,27. Çift boyama yöntemi kullanıldığında (yani, uranyl asetat ile boyama kurşun ile tedavi takip edilir), ikinci bir uranyl asetat boyama geliştiricisi olarak davranır. Örneğin, glutaraldehit ile sabit kromatin kurşun sonrası boya üç28,29,30,31,32bir faktör tarafından uranyl asetat alımı artar. Lead de Osmium gibi diğer metaller tarafından öğretilir boyama geliştirir. Bu kurşun tuzları azalmış osmiyum33varlığında fosfatidler kutup grubuna iliştirerek osmiyum-sabit dokuların membranlarının leke düşünülmektedir. Hem uranyl asetat ve kurşun ile boyama potansiyel bir dezavantajı, özellikle uzun süreli süreleri için, birçok farklı yapısal elemanlar eşit ve non-özellikle lekelenmiş olduğunu ve böylece kolayca diğerine ayırt edilmeyebilir12 .
Optik süper çözünürlüklü fotoğraf aktive yerelleştirme mikroskobu gibi alternatif ışık kaynaklarının son giriş, önemli ölçüde ışık mikroskobu çözünürlüğü34geliştirdi. Ancak, ışık mikroskopisi tek etiketli proteinlerin veya enzimlerin görselleştirilmesi için histokimyasal ve bağışıklık-sitokimyasal yöntemlerle bağlı olduğundan, TEM ‘in tüm yapısal elemanları bir kerede görüntülemeleri, derinlemesine çalışma için benzersiz kalır doku yapılarının Morfoloji ve boyutsal ilişkileri. Özellikle, başka hiçbir tekniği önceden sinaptik sinir Boutons sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi gerçekleştirmek için gerekli morfolojik ayrıntı sağlayabilir. Yine de, elektronik mikrografinin organizma öldükten sonra dokusunun yapısını yakalamasını ve bu nedenle ön sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamiklerine ilişkin bilgi veremiyor olması önemlidir. Bu nedenle, FM boya-canlı görüntüleme ve yama-kelepçe elektrofizyolojisi gibi diğer araçlar, ana amaç sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamik ve/veya işlevsel yönlerini incelemek için olduğunda dikkate alınmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM için numune hazırlama sırasında doku bölümlerinin işlenmesi önemli ölçüde incelik, konsantrasyon ve sabır gerektirir. Çözümler eklemek ve kaldırmak için bir mikropipet kullanırken, numuneler yüzey gerilimi ile Pipet ucunu içine çekilebilir, bu nedenle pipet tarafından doku hasarından kaçınmak için büyük bir özen gösterilebilir. Ayrıca, dehidrasyon dizisinin belirli adımlar kadar hızlı olabilir 1 dakika, bu nedenle operatör hızlı bir sonraki dehidrasyon adım zamanında başlatıld…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazıda NıH/NIGMS K08 123321 (N.L.) ve Virginia Üniversitesi Anesteziyoloji bölümü ‘nden fon tarafından destekleniyordu. Yazarlar, TEM ile mükemmel eğitim ve teknik yardım ve onun paha biçilemez el yazması eleştirileri için alev erisir ‘e (Biyoloji bölümü, Virginia Üniversitesi, Charlottesville, VA) teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca numune bölümleme ve sonrası boyama ile teknik yardım için Virginia Üniversitesi ‘nde gelişmiş elektron mikroskopisi tesisi teşekkür ederiz.
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
Riferimenti
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C., Santini, M. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. , 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. , 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A., Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
- Behrman, E. J., et al., Revel, J. P., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. , 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G., Heyn, C., Forssmann, W. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. , 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
