استخدام اللافقاريات جاليريا ميلونيلا كنموذج للعدوى لدراسة مجمع السل الميكوباكتيريوم
Summary
تم تأسيس غاليريا ميلونيلا مؤخرا كنموذج للعدوى القابلة للاستنساخ ورخيصة ومقبولة أخلاقيا لمجمع السل الميكوباكتيريوم. هنا نحن وصف وبيان الخطوات المتخذة لإنشاء عدوى ناجحة من ج. ميلونيلا مع الميكوباكتيريوم بوفيس BCG لوكس.
Abstract
السل هو السبب العالمي الرئيسي لوفيات الأمراض المعدية، ويعتقد أن ما يقرب من ربع سكان العالم مصابون بالسل الميكوباكتيريوم. على الرغم من عقود من البحث، العديد من الآليات الكامنة وراء نجاح M. السل ككائن ممرض لا يزال يتعين التحقيق، وتطوير أكثر أمانا، وأكثر فعالية العقاقير المضادة للبكتيريا هناك حاجة ماسة لمعالجة ارتفاع و انتشار السل المقاوم للأدوية. ومع ذلك، فإن تطور أبحاث السل هو عنق الزجاجة من قبل نماذج عدوى الثدييات التقليدية التي هي مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، وتحديا أخلاقيا. في السابق أنشأنا يرقات الحشرة غاليريا ميلونيلا (عثة الشمع الأكبر) كنموذج جديد، قابل للتكرار، منخفض التكلفة، عالي الإنتاجية ومقبول أخلاقياً لأعضاء مجمع السل M. هنا نحن وصف الصيانة والإعداد، والعدوى من ج. ميلونيلا مع الميكوباكتريوم بوفيس BCG لوكس. باستخدام هذا النموذج العدوى، يمكن ملاحظة جرعة ميكونية تعتمد على الفوعة، وقراءة سريعة من العبء الفطري في الجسم الحي باستخدام قياسات الإضاءة الحيوية يمكن تحقيقها بسهولة وقابلة للاستنساخ. على الرغم من وجود قيود، مثل عدم وجود جينوم مشروح بالكامل للتحليل المستنسخ، يمكن إجراء تحليل الانطولضد ضد الحشرات المتشابهة وراثيا. كنموذج منخفض التكلفة وسريع ومقبول أخلاقيا ً للسل، يمكن استخدام G. ميلونيلا كشاشة مسبقة لتحديد فعالية الدواء وسميته، وتحديد الفيوية البكتيرية النسبية قبل استخدام الثدييات التقليدية نماذج. استخدام نموذج ج. ميلونيلا-البكتيريا الفطرية سيؤدي إلى انخفاض في عدد كبير من الحيوانات المستخدمة حاليا في أبحاث السل.
Introduction
السل هو تهديد كبير للصحة العامة في العالم مع 9 ملايين حالة جديدة سنويا و 1.5 مليون حالة وفاة1. وبالإضافة إلى ذلك، ويقدر أن ربع سكان العالم مصابون بالعامل المسبب للمرض، وهو مرض السل الميكوباكتيريوم (Mtb). ومن بين المصابين، سيصاب 5-10% بمرض السل النشط على مدى حياتهم. وعلاوة على ذلك، فإن ظهور وانتشار مقاومة للأدوية المتعددة ومقاومة للأدوية على نطاق واسع يشكل تهديدا خطيرا لمكافحة الأمراض، حيث أبلغ 123 بلدا عن حالة واحدة على الأقل من حالات الـ XDR1. ويتطلب علاج السل تناول ما لا يقل عن أربعة عقاقير مضادة للبكتيريا، توصف منها الإيزونيازيد والريفامبيتسين لمدة لا تقل عن ستة أشهر؛ غالباً ما يرتبط العلاج مع الآثار الجانبية المعقدة والسموم. الحماية من اللقاح الوحيد المرخص ضد السل، الميكوباكتريوم بوفيس عصية كالميت-غيرين (BCG)، هو المتغير2. إن الفهم غير الكامل لمسببات الإمراض التي تسببها السل يعوق بشكل كبير وضع استراتيجيات علاجية وتطعيمجديدة.
على مدى عقود كانت نماذج العدوى الحيوانية حيوية لأبحاث السل لفهم مسببات الأمراض الأساسية واستجابة المضيف للعدوى، وتقييم العوامل الجديدة المضادة للبكتيريا، والعلاجات المناعية والمرشحات لقاح جديد3، 4. ومع ذلك، فإن البحوث التي تستخدم نماذج العدوى الحيوانية من السل من الصعب جدا ً ً ً، حيث أن الإمراض وتطور عدوى السل معقدة، ولا يوجد نموذج واحد للأنواع الحيوانية يحاكي الطيف الكامل والسمات الهامة للمرض5 6. وعلاوة على ذلك، فإن التجارب على الحيوانات مكلفة، وتستغرق وقتا طويلا للقيام بها وتتطلب تبريرا أخلاقيا كاملا. ومع ذلك، تم وصف نماذج العدوى الحيوانية للسل في الرئيسيات غير البشرية (مثل المكاك)، وخنازير غينيا، والأرانب، والماشية، والخنازير، والفئران وأسماك الحمار الوحشي، مع وجود حدود كل منها3،4. نموذج المورين هو النموذج الأكثر استخداما بسبب التكلفة، وتوافر خطوط أصيلة، وإمكانية تكرار العدوى ووفرة الكواشف المناعية. ومع ذلك، فإنها لا تشكل عادة الأورام الحبيبية المرتبطة بمناطق نقص الأكسجة التي هي سمة من سمات عدوى السل الكامنة (LTBI)6. والخنازير الغينية شديدة التأثر بعدوى الفيتامين المتري، مع الإصابة بأمراض الأمراض وتشكيل الورم الحبيبي المبكر على غرار تلك الموجودة لدى البشر، وتستخدم على نطاق واسع في اختبار اللقاحات؛ بعد عدم وجود الكواشف المناعية يعوق استخدامها كنموذج العدوى7. أسماك حمار وحشي مناسبة للفحص على نطاق واسع في الدراسات قبل السريرية في مرحلة مبكرة بسبب صغر حجمها، والتكاثر السريع والأدوات الوراثية المتقدمة، ولكنها مختلفة تشريحيا وفسولوجيا للبشر وغير عرضة فقط ل الميكوباكتيريوم المانوم العدوى3. النماذج الحيوانية تشبه عن كثب عدوى Mtb البشرية هي الرئيسيات غير البشرية (على سبيل المثال، المكاك)، لكنها مكلفة ولها اعتبارات أخلاقية وعملية كبيرة التي تحد إلى حد كبير من استخدامها8.
اليرقة الحشرات من العثة الشمع أكبر أو عثة العسل، غاليريا ميلونيلا ، أصبحت شعبية متزايدة كنموذج للعدوى لمجموعة متنوعة من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية9، وكشاشة لمرشحين المخدرات المضادة للميكروبات رواية 10. ج. ميلونيلا هو نموذج لافقاري ناجح بسبب جهازه المناعي الفطري المتطور (المؤلف من دفاعات خلوية وفكاهية) الذي يتقاسم درجة عالية من التشابه الهيكلي والوظيفي مع نسبة الفقاريات11 . وهذا يشمل آليات المناعة مثل البلوسيات من مسببات الأمراض من قبل الخلايا الهيموسيد (وظيفيا مماثلة لبلبلة الثدييات والعدلات)12،13، وإنتاج وتداول الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) و البروتينات الشبيهة بالتكامل داخل الهيمولم (مشابهة لدم الثدييات) من G. ميلونيلا11. مزاياأخرى 9،14،15 من اليرقات G. ميلونيلا كنموذج تشمل 1) حجمها الكبير (20-30 ملم) الذي يسمح لسهولة التلاعب والعدوى، فضلا عن جمع الأنسجة و الهيمولم للتحاليل، 2) صيانة سهلة في 37 درجة مئوية، متوافقة لدراسة مسببات الأمراض البشرية، 3) عدوى دقيقة عن طريق الحقن دون الحاجة إلى التخدير، 4) فعالية من العوامل المضادة للميكروبات يمكن تقييماستخدام أقل المخدرات للتقييم، 5) عدم وجود القيود الأخلاقية مقارنة باستخدام الثدييات، 6) يمكن استخدام أحجام المجموعات الكبيرة مقارنة بالنماذج الحيوانية التي تسمح بقدر أكبر من الاستنساخ، و 7) يلزم أوقات أقصر لتجارب العدوى.
في دراسة حديثة، أظهرنا أن G. ميلونيلا يمكن استخدامها كنموذج عدوى جديدة لدراسة مسببات الأمراض من قبل الإضاءة الحيوية M. بوفيس BCG لوكس، وهي نسخة معدلة وراثيا من سلالة اللقاح وعضو 16 ةيلابةةيلاف ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلا في حين تم سابقا استخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى للبكتيريا الفطرية غير السلية (NTM), أساسا M. المارينيوم وخراج الميكوباكتيريوم17,18, تقتصر الدراسات باستخدام MTBC إلى أن من لي وآخرون16. سلالات ميكونجتيرية غير مسببة للأمراض، والتي يمكن استخدامها عند مستوى الاحتواء (CL) 2 كبديل لMtb، توفر مزايا السلامة والتطبيق العملي على البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض. بعد العدوى مع BCG لوكس، تبدأ اليرقات في تطوير هياكل تشبه الورم الحبيبي المبكر ، والتي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة قيمة في دور المناعة الفطرية في إنشاء عدوى السل16. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النموذج البسيط من العدوى اللافقارية ينطوي على إمكانية توفير تقييم سريع ومنخفض التكلفة وموثوق به لمسببات مرض السل يتضمن تحديًا خاضعًا للرقابة وتكرارًا متعددًا لإمكانية التكاثر. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج ينطوي على إمكانية استخدامه لفحص المرشحين الرواية للأدوية واللقاحات المضادة للسل في مرحلة مبكرة من التطوير، مما يقلل من العدد الإجمالي للحيواناتهم في التجارب. كما أن القدرة على قياس التغيرات في هيكل المضيف والممرض، والنسخ، والبروتيتومي لتحديد أهداف المخدرات وتقييم آليات عمل العقاقير الجديدة واللقاحات العلاجية، هي أيضاً مفيدة.
هنا نحن نوصف البروتوكولات التجريبية لإعداد الإنارة الحيوية M. بوفيس BCG لوكس inoculum وG. ميلونيلا اليرقات للعدوى الفطرية، فضلا عن تحديد كل من اليرقات وmycobacterial البقاء على قيد الحياة استجابة للعدوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تأسيس استخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى لعدد من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية لدراسة الفوعة، والتفاعل بين المضيف وممرض، وكشاشة لعلاجات جديدة10،22. وتستند المناقشة التالية على الإجراء التجريبي لاستخدام G. ميلونيلا كنموذج للعدوى MTBC.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا المشروع بمنح من مجلس بحوث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BBSRC)، التي منحت لPRL وYL (BB/P001262/1)، والمركز الوطني لاستبدال الحيوانات في البحوث وصقلها والحد منها (NC3Rs) الممنوحة لـ PRL، SMN, BDR, and YL (NC/R001596/1).
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
Riferimenti
- World Health Organization. . Global tuberculosis report 2018. , (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research – where is the beef?. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella – a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis – BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
