利用无脊椎杆菌作为感染模型研究结核分枝杆菌复合物
Summary
最近,肺结核分枝杆菌的可重复、廉价和合乎道德的感染模型被确立为一种可重复、廉价和合乎道德的感染模式。在这里,我们描述和演示了为成功感染生物发光分枝杆菌BCG lux而采取的措施。
Abstract
结核病是全球传染病死亡的主要原因,全世界约有四分之一的人口被认为感染了结核分枝杆菌。尽管进行了几十年的研究,但结核病作为致病性有机体成功背后的许多机制仍有待研究,迫切需要开发更安全、更有效的抗菌药物,以应对其上升趋势和耐药结核病的传播。然而,结核病研究的进展受到传统哺乳动物感染模式的瓶颈,这种模式成本高昂、耗时且在伦理上具有挑战性。此前,我们建立了昆虫巨虫(大蜡蛀虫)的幼虫,作为一种新颖的、可重复的、低成本的、高通量的、在伦理上可接受的感染模型,适用于M.结核病复合体的成员。在这里,我们描述了G.梅隆藻的维护,制备和感染与生物发光分枝杆菌BCG lux。使用这种感染模型,可以观察到分菌剂量依赖性毒性,并且使用生物发光测量快速读出体内的分体剂负担是很容易实现的和可重复的。尽管存在局限性,例如缺乏用于转录组分析的完全带批过的基因组,但可以对基因相似的昆虫进行本体分析。作为一种低成本、快速且道德上可接受的结核病模型,G. mellonella可用作预筛选,以确定药物疗效和毒性,并在使用传统哺乳动物之前确定比较分线杆菌毒性模型。使用G.梅隆氏杆菌模型将减少目前用于结核病研究的大量动物数量。
Introduction
结核病是全球公共卫生的主要威胁,每年有900万新发病例和150万例死亡。此外,据估计,世界人口的四分之一感染了该病的病原体,肺结核分枝杆菌(Mtb)。在受感染人群中,5-10%的人在其一生中会发展为活动性结核病。此外,耐多药药(MDR)和广泛耐药Mtb的出现和蔓延对疾病控制构成严重威胁,123个国家报告至少有一例XDR病例1。结核病的治疗需要至少四种抗霉菌药物的鸡尾酒,其中无尼菌和利福平的处方期限至少为六个月;治疗通常与复杂的副作用和毒性相关。唯一获得许可的结核病疫苗,博维斯杆菌杆菌(BCG)的保护是可变的2。对结核病发病机制的不完全了解严重阻碍了新的治疗和疫苗接种策略的发展。
几十年来,动物感染模型对于结核病研究了解感染的基本发病机制和宿主反应,以及评估新型抗分菌制剂、免疫疗法和新疫苗候选药物至关重要。 4.然而,使用结核病动物感染模型的研究是出了名的困难,因为结核病感染的发病机制和进展是复杂的,并且没有一个单一的动物模型可以模仿疾病的全部谱系和重要特征5 ,6.此外,动物实验费用昂贵,耗时,需要充分的道德理由。然而,在非人类灵长类动物(如猴)、豚鼠、兔子、牛、猪、小鼠和斑马鱼中,有结核病的动物感染模型,每种都有其局限性3、4。由于成本、近亲繁殖系的可用性、感染的可重复性和免疫试剂的丰富性,鼠类模型是最常用的模型。然而,它们通常不会形成与缺氧区域相关的肉芽肿,这些缺氧区域是潜伏性肺结核感染(LTBI)6。几内亚猪极易感染Mtb,病理学和早期肉芽瘤形成与人类相似,并广泛用于疫苗测试;然而,缺乏免疫试剂阻碍了他们作为感染模式7的使用。斑马鱼由于其体积小、繁殖速度快、遗传工具先进,在临床前研究中适合大规模筛选,但在解剖学和生理上与人类不同,只易受到分枝杆菌感染3.最类似于人类Mtb感染的动物模型是非人类灵长类动物(例如,猴),但它们价格昂贵,并且具有重要的伦理和实际考虑,大大限制了它们的使用8。
大蜡蛀虫或蜂窝蛀虫的昆虫幼虫,作为各种细菌和真菌病原体的感染模型,作为新型抗菌药物候选药物的屏幕,已越来越受欢迎10. G. 梅隆纳是一个成功的无脊椎动物模型,由于其复杂的先天免疫系统(由细胞和体液防御组成),与脊椎动物的高度结构和功能相似性11.这包括免疫机制,如血细胞对病原体的噬菌体(功能上类似于哺乳动物巨噬细胞和嗜中性粒细胞)12、13、抗微生物肽(AMPs)的生产和循环,以及G. 梅隆内拉11的血淋巴(类似于哺乳动物血液)中的补体状蛋白质。其他优势9,14,15的G. 梅隆拉幼虫模型包括 1) 其大尺寸 (20–30 毫米), 允许容易的操作和感染, 以及组织和收集用于分析的溶量,2)在37°C下易于维护,兼容研究人类病原体,3)无需麻醉而注射精确感染,4)抗菌剂的疗效可评估使用较少的药物进行评估,5)缺乏与使用哺乳动物相比,伦理限制,6)大组尺寸可以使用相比动物模型,允许更大的可重复性,7)更短的时间进行感染实验。
在最近的一项研究中,我们证明了G.mellonella可以作为一种新的感染模型来研究生物发光M.bovis BCG lux的感染发病机制,这是一种转基因版本的疫苗菌株和成员Mtb综合体(MTBC)16。虽然G. 梅隆纳以前曾被用作非结核分枝杆菌(NTM)的感染模型,主要是M.Marinum和分枝杆菌脓肿17,18,使用MTBC的研究仅限于李等人的16。生物致发光非致病性分枝杆菌菌株,可在密封水平(CL)2用作Mtb的代用品,比致病性分枝杆菌具有安全性和实用性的优点。在感染BCG lux后,幼虫开始发展早期肉芽肿样结构,这可能为了解先天免疫在结核病感染16的建立中的作用提供有价值的见解。此外,这种简单的无脊椎动物感染模型有可能为结核病发病机制提供快速、低成本和可靠的评估,包括受控挑战和多重复制,以实现可重复性。此外,该模型还有可能用于筛选早期开发中的新型抗结核药物和疫苗候选药物,从而减少实验动物的总数。测量宿主和病原体结构、转录组和蛋白酶的变化以确定药物靶点和评估新药和治疗性疫苗作用机制的能力也是有益的。
在这里,我们描述了制备生物发光体 M. bovis BCG lux 接种剂和G. 梅隆ella幼虫用于分体细菌感染的实验方案,以及幼虫和分乳杆菌的测定因感染而存活。
Protocol
Representative Results
Discussion
利用G.mellonella作为感染模型,为一些细菌和真菌病原体的研究毒性,宿主-病原体相互作用,并作为屏幕为新的治疗10,22。以下讨论基于使用G.梅隆内拉作为MTBC感染模型的实验程序。
实验前幼虫的健康会对实验结果产生相当大的影响。因此,任何变色和/或受伤的幼虫在抵达时被移除,并且不用于任何实验,这一点至关重?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目得到了生物技术和生物科学研究理事会(BBSRC)的赠款支持,赠款授予PRL和YL(BB/P001262/1),以及国家研究动物替代、改良和减少中心(NC3R),授予PRL,SMN、BDR 和 YL (NC/R001596/1)。
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
Riferimenti
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