Gebruik van de ongewervelde Galleria wasmot als een infectie model voor de studie van de Mycobacterium tuberculose complex
Summary
Galleria wasmot werd onlangs opgericht als een reproduceerbaar, goedkoop, en ethisch aanvaardbare infectie model voor de Mycobacterium tuberculose complex. Hier beschrijven en demonstreren we de stappen die genomen zijn om succesvolle infectie van G. wasmot met bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux vast te stellen .
Abstract
Tuberculose is de leidende wereldwijde oorzaak van besmettelijke ziekte sterfte en ongeveer een kwart van de wereldbevolking wordt verondersteld te worden besmet met Mycobacterium tuberculose. Ondanks decennia van onderzoek, moeten veel van de mechanismen achter het succes van M. tuberculose als pathogene organisme worden onderzocht, en de ontwikkeling van veiliger, efficiëntere antimycobacterial drugs is dringend nodig om de stijging te behandelen en verspreiding van resistente tuberculose. Echter, de progressie van tuberculose onderzoek is knelpunten door de traditionele zoogdier infectie modellen die zijn duur, tijdrovend, en ethisch uitdagend. Eerder hebben we de larven van het insect Galleria wasmot (grotere Wax Moth) als een nieuwe, reproduceerbare, lage kosten, high-throughput en ethisch aanvaardbaar infectie model voor de leden van de M. tuberculose complex. Hier beschrijven we het onderhoud, de voorbereiding en de infectie van G. wasmot met bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux. Met behulp van deze infectie model, mycobacteriële dosisafhankelijke virulentie kan worden waargenomen, en een snelle uitlezing van in vivo mycobacteriële last met behulp van bioluminescentie metingen is gemakkelijk haalbaar en reproduceerbaar. Hoewel er beperkingen bestaan, zoals het ontbreken van een volledig geannoteerde genoom voor transcriptomics analyse, kan ontologische analyse tegen genetisch gelijkaardige insecten worden uitgevoerd. Als een lage kosten, snel en ethisch aanvaardbaar model voor tuberculose, G. wasmot kan worden gebruikt als een pre-Screen om de effectiviteit van geneesmiddelen en toxiciteit te bepalen, en om te bepalen vergelijkende mycobacteriële virulentie voorafgaand aan het gebruik van conventionele zoogdieren Modellen. Het gebruik van het G. wasmot-mycobacteriën-model zal leiden tot een vermindering van het grote aantal dieren dat momenteel in het tuberculose onderzoek wordt gebruikt.
Introduction
Tuberculose (TB) is een belangrijke bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid met 9.000.000 nieuwe gevallen per jaar en 1.500.000 sterfgevallen1. Bovendien wordt geschat dat een kwart van de wereldbevolking is geïnfecteerd met de oorzakelijke agent van de ziekte, Mycobacterium tuberculose (MTB). Onder de geïnfecteerde bevolking, 5 − 10% zal de ontwikkeling van actieve TB ziekte over hun leven. Bovendien, de opkomst en verspreiding van multi-drug resistente (MDR) en uitgebreid-drug (XDR) resistente MTB vormt een ernstige bedreiging voor de Ziektebestrijding, met 123 landen de rapportage ten minste een XDR geval1. Behandeling van TB vereist een cocktail van ten minste vier anti-mycobacteriële geneesmiddelen, waarvan isoniazid en rifampicin worden voorgeschreven voor een minimumduur van zes maanden; de behandeling wordt vaak geassocieerd met complexe bijwerkingen en toxische effecten. Bescherming tegen de enige licentie vaccin tegen TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-GUÉRIN (BCG), is variabel2. Een onvolledig begrip van de pathogenese van TB belemmert de ontwikkeling van nieuwe therapeutische en vaccinatiestrategieën aanzienlijk.
Voor decennia dierlijke infectie modellen zijn van vitaal belang voor TB onderzoek naar de fundamentele pathogenese en gastheer reactie op infectie te begrijpen, en om nieuwe anti-mycobacteriële agenten, immuun-therapeutische en nieuw vaccin kandidaten3te evalueren, 4. echter, onderzoek met behulp van dierlijke infectie modellen van TB is berucht moeilijk als de pathogenese en progressie van TB-infectie zijn complex, en er is geen enkel diermodel dat het volledige spectrum en de belangrijke kenmerken van de ziekte nabootst5 ,6. Bovendien zijn dierproeven duur, tijdrovend om te ondernemen en vereisen volledige ethische rechtvaardiging. Toch zijn dierlijke infectie modellen van TB beschreven in niet-menselijke primaten (bijv. Makaken), cavia’s, konijnen, vee, varkens, muizen en zebravis, met elk met hun beperkingen3,4. De muizenmodel is het meest gebruikte model als gevolg van kosten, beschikbaarheid van ingeteelde lijnen, reproduceerbaarheid van de infectie en de overvloed van immunologische reagentia. Echter, ze niet typisch vorm granulomen geassocieerd met gebieden van hypoxie die kenmerkend zijn voor latente tuberculose-infectie (LTBI)6. Cavia’s zijn zeer gevoelig voor MTB -infectie, met pathologie en vroege granuloomvorming vergelijkbaar met die in de mens, en worden veel gebruikt in vaccin testen; Toch is het gebrek aan immunologische reagentia belemmert het gebruik ervan als een infectie model7. Zebravis zijn geschikt voor grootschalige screening in vroege stadia Preklinische studies vanwege hun geringe omvang, snelle voortplanting en geavanceerde genetische hulpmiddelen, maar zijn anatomisch en fysiologisch verschillend van de mens en zijn alleen vatbaar voor Mycobacterium Marinum besmetting3. De diermodellen die het meest lijken op de menselijke MTB -infectie zijn niet-menselijke primaten (bijvoorbeeld de Makaken), maar ze zijn duur en hebben belangrijke ethische en praktische overwegingen die aanzienlijk beperkt hun gebruik8.
De insecten larve van de grotere Wax mot of honingraat mot, Galleria wasmot, zijn steeds populairder geworden als een infectie model voor een verscheidenheid van bacteriële en schimmel pathogenen9, en als een scherm voor nieuwe antimicrobiële drugs kandidaten 10. G. wasmot is een succesvolle ongewervelde model te wijten aan zijn verfijnde aangeboren immuunsysteem (bestaande uit cellulaire en humorale verdediging) dat een hoge mate van structurele en functionele gelijkenis met die van gewervelde dieren11 aandelen . Dit omvat immune mechanismen zoals fagocytose van ziekteverwekkers door hemocytes (functioneel gelijkaardig aan zoogdier macrofagen en neutrofielen)12,13, de productie en de omloop van anti-microbiële peptides (versterkers) en aanvulling-als proteïnen binnen hemolymph (analoog aan zoogdier bloed) van G. wasmot11. Andere voordelen9,14,15 van G. wasmot de larven als model omvatten 1) hun grote grootte (20 − 30 mm) die voor gemakkelijke manipulatie en besmetting toestaat, evenals de inzameling van weefsel en hemolymph voor analyses, 2) gemakkelijk onderhoud bij 37 °C, geschikt voor het bestuderen van menselijke pathogenen, 3) precieze infectie door injectie zonder de noodzaak voor anesthesie, 4) effectiviteit van antimicrobiële stoffen kan worden beoordeeld met behulp van minder drugs voor de evaluatie, 5) gebrek aan ethische beperkingen ten opzichte van het gebruik van zoogdieren, 6) de grote groepsgrootte kan worden gebruikt in vergelijking met dierlijke modellen die grotere reproduceerbaarheid toestaan, en 7) kortere tijden voor besmettings experimenten zijn vereist.
In een recente studie, hebben we aangetoond dat G. wasmot kan worden gebruikt als een nieuwe infectie model voor het bestuderen van de pathogenese van de infectie door bioluminescent M. bovis BCG Lux, een genetisch gemodificeerde versie van het vaccinstam en de lidstaten van de MTB -complex (MTBC)16. Terwijl G. wasmot eerder is gebruikt als een infectie model voor niet-tuberculose mycobacteriën (NTM), voornamelijk M. marinum en Mycobacterium abcesus17,18, studies met behulp van MTBC zijn beperkt tot dat van Li et al.16. Bioluminescent niet-pathogene mycobacteriële stammen, die kunnen worden gebruikt op insluiting niveau (CL) 2 als een surrogaat voor MTB, bieden de voordelen van veiligheid en uitvoerbaarheid over pathogene mycobacteriën. Na besmetting met BCG Lux, beginnen de larven vroege granuloom-als structuren te ontwikkelen, die waardevol inzicht in de rol van ingeboren immuniteit in de totstandbrenging van TB besmetting16konden verstrekken. Bovendien, deze eenvoudige ongewervelde infectie model heeft de potentie om een snelle, goedkope, en betrouwbare evaluatie van TB pathogenese waarin gecontroleerde uitdaging en meerdere repliceert voor reproduceerbaarheid te bieden. Bovendien, het model heeft de potentie om te worden gebruikt om nieuwe anti-TB drugs en vaccin kandidaten scherm in de vroege ontwikkeling, het verminderen van het totale aantal dieren in experimenten. Het vermogen om veranderingen in gastheer en pathogeen structuur, transcriptoom en proteome te meten om drug doelstellingen te bepalen en mechanismen van actie van nieuwe drugs en therapeutische vaccins te beoordelen, zijn ook voordelig.
Hier beschrijven we de experimentele protocollen voor de voorbereiding van een bioluminescent M. bovis BCG Lux entmateriaal en G. wasmot larven voor mycobacteriële infectie, evenals de bepaling van zowel larvale en mycobacteriële overleving in reactie op infectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van G. wasmot als een infectie model is vastgesteld voor een aantal bacteriële en schimmelziekte verwekkers voor de studie van virulentie, gastheer-pathogeen interactie, en als een scherm voor nieuwe therapeutische10,22. De volgende bespreking is gebaseerd op de experimentele procedure voor het gebruik van G. wasmot als besmettings model voor MTBC.
De gezondheid van de naïeve larven voorafgaand …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd ondersteund door subsidies van de biotechnologie en biologisch wetenschappelijk Onderzoekraad (BBSRC), toegekend aan PRL en YL (BB/P001262/1), en het nationaal centrum voor de vervanging, verfijning en vermindering van dieren in onderzoek (NC3Rs) toegekend aan PRL, SMN, BDR, en YL (NC/R001596/1).
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
Riferimenti
- World Health Organization. . Global tuberculosis report 2018. , (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research – where is the beef?. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella – a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis – BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
