Utilisation de l'invertébré Galleria mellonella comme modèle d'infection pour étudier le complexe mycobacterium de tuberculose
Summary
Galleria mellonella a été récemment établi comme un modèle d’infection reproductible, bon marché et éthiquement acceptable pour le complexe de mycobacterium tuberculosis. Ici nous décrivons et démontrons les étapes prises pour établir l’infection réussie de G. mellonella avec le Mycobacterium bioluminescent bovis BCG lux.
Abstract
La tuberculose est la principale cause mondiale de mortalité par maladie infectieuse et environ un quart de la population mondiale serait infectée par Mycobacterium tuberculosis. Malgré des décennies de recherche, de nombreux mécanismes à l’origine du succès de M. tuberculosis en tant qu’organisme pathogène restent à étudier, et le développement de médicaments antimycobactériens plus sûrs et plus efficaces est nécessaire de toute urgence pour faire face à la hausse et la propagation de la tuberculose pharmacorésistante. Cependant, la progression de la recherche sur la tuberculose est en proie à des modèles traditionnels d’infection des mammifères qui sont coûteux, longs et éthiquement difficiles. Auparavant, nous avons établi les larves de l’insecte Galleria mellonella (plus grand papillon de cire) comme un nouveau modèle d’infection reproductible, à faible coût, à haut débit et éthiquement acceptable pour les membres du complexe M. tuberculosis. Ici nous décrivons l’entretien, la préparation, et l’infection de G. mellonella avec le Mycobacterium bioluminescent bovis BCG lux. À l’aide de ce modèle d’infection, la virulence dépendante de la dose mycobactérienne peut être observée, et une lecture rapide de la charge mycobactérienne in vivo à l’aide de mesures de bioluminescence est facilement réalisable et reproductible. Bien qu’il existe des limites, comme l’absence d’un génome entièrement annoté pour l’analyse transcriptomique, une analyse ontologique contre des insectes génétiquement similaires peut être effectuée. Comme modèle à faible coût, rapide et éthiquement acceptable pour la tuberculose, G. mellonella peut être utilisé comme pré-écran pour déterminer l’efficacité et la toxicité des médicaments, et pour déterminer la virulence mycobactérienne comparative avant l’utilisation de mammifères conventionnels Modèles. L’utilisation du modèle G. mellonella-mycobacteriapermettra de réduire le nombre important d’animaux actuellement utilisés dans la recherche sur la tuberculose.
Introduction
La tuberculose est une menace majeure pour la santé publique mondiale avec 9 millions de nouveaux cas par an et 1,5 million de décès1. En outre, on estime qu’un quart de la population mondiale est infectée par l’agent causal de la maladie, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Parmi la population infectée, 5 à 10 % développeront une tuberculose active au cours de leur vie. En outre, l’émergence et la propagation de MTB multirésistants (MDR) et résistants aux médicaments (XDR) constitue une menace sérieuse pour la lutte contre la maladie, 123 pays signalant au moins un cas de XDR1. Le traitement de la tuberculose nécessite un cocktail d’au moins quatre médicaments antimycobactériens, dont l’isoniazide et la rifampicine sont prescrites pour une durée minimale de six mois; le traitement est souvent associé aux effets secondaires et aux toxicités complexes. La protection contre le seul vaccin homologué contre la tuberculose, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), est variable2. Une compréhension incomplète de la pathogénie de la tuberculose entrave considérablement l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques et de vaccination.
Pendant des décennies, les modèles d’infection animale ont été essentiels pour la recherche sur la tuberculose afin de comprendre la pathogénie de base et la réponse de l’hôte à l’infection, et d’évaluer de nouveaux agents antimycobactériens, immunothérapeutiques et de nouveaux vaccins candidats3, 4. Cependant, la recherche utilisant des modèles d’infection animale de la tuberculose est notoirement difficile car la pathogénie et la progression de l’infection à tuberculose sont complexes, et il n’existe pas de modèle animal unique qui imite le spectre complet et les caractéristiques importantes de la maladie5 ,6. En outre, les expériences sur les animaux sont coûteuses, prennent beaucoup de temps à entreprendre et nécessitent une justification éthique complète. Néanmoins, des modèles d’infection animale de la tuberculose ont été décrits chez des primates non humains (p. ex. macaques), des cobayes, des lapins, des bovins, des porcs, des souris et des poissons zèbres, chacun ayant ses limites3,4. Le modèle murine est le modèle le plus couramment utilisé en raison du coût, de la disponibilité des lignées consanguines, de la reproductibilité de l’infection et de l’abondance des réactifs immunologiques. Cependant, ils ne forment généralement pas de granulomes associés à des zones d’hypoxie qui sont caractéristiques de l’infection tuberculeuse latente (LTBI)6. Les cochons d’Inde sont très sensibles à l’infection à Mtb, avec une pathologie et une formation précoce de granulomes semblables à ceux chez l’homme, et sont largement utilisés dans les tests de vaccination; pourtant, l’absence de réactifs immunologiques entrave leur utilisation comme modèle d’infection7. Les poissons zèbres conviennent au dépistage à grande échelle dans les études précliniques à un stade précoce en raison de leur petite taille, de leur reproduction rapide et de leurs outils génétiques avancés, mais ils sont anatomiquement et physiologiquement différents des humains et ne sont Mycobacterium marinum infection3. Les modèles animaux qui ressemblent le plus étroitement à l’infection humaine de Mtb sont les primates non humains (par exemple, le macaque), mais ils sont chers et ont des considérations éthiques et pratiques importantes qui limitent considérablement leur utilisation8.
La larve d’insecte de la plus grande teigne de cire ou papillon de nuit nid d’abeilles,Galleria mellonella, sont devenus de plus en plus populaires comme modèle d’infection pour une variété d’agents pathogènes bactériens et fongiques9, et comme un écran pour les nouveaux candidats aux médicaments antimicrobiens 10. G. mellonella est un modèle d’invertébré réussi en raison de son système immunitaire inné sophistiqué (composé de défenses cellulaires et humoristiques) qui partage un degré élevé de similitude structurale et fonctionnelle à celle des vertébrés11 . Cela comprend les mécanismes immunitaires tels que la phagocytose des agents pathogènes par les hémocytes (fonctionnellement similaires aux macrophages et aux neutrophiles des mammifères)12,13, la production et la circulation de peptides antimicrobiens (AMP) et protéines de type complément dans l’hémolymphe (analogue au sang de mammifères) de G. mellonella11. D’autres avantages9,14,15 de larves de G. mellonella comme modèle comprennent 1) leur grande taille (20-30 mm) qui permet une manipulation facile et l’infection, ainsi que la collecte de tissus et hémolymphe pour les analyses, 2) entretien facile à 37 oC, compatible pour l’étude des agents pathogènes humains, 3) infection précise par injection sans besoin d’anesthésie, 4) l’efficacité des agents antimicrobiens peut être évaluée en utilisant moins de médicament pour l’évaluation, 5) l’absence de contraintes éthiques par rapport à l’utilisation des mammifères, 6) grandes tailles de groupe peuvent être utilisés par rapport aux modèles animaux permettant une plus grande reproductibilité, et 7) des temps plus courts pour les expériences d’infection sont nécessaires.
Dans une étude récente, nous avons démontré que G. mellonella peut être utilisé comme un nouveau modèle d’infection pour étudier la pathogénie de l’infection par bioluminescent M. bovis BCG lux, une version génétiquement modifiée de la souche vaccinale et membre du complexe Mtb (MTBC)16. Alors que G. mellonella a déjà été utilisé comme modèle d’infection pour les mycobactéries non tuberculeuses (NTM), principalement M. marinum et Mycobacterium abcès17,18, les études utilisant MTBC sont limitées à celle de Li et coll.16. Les souches mycobactériennes bioluminescentes non pathogènes, qui peuvent être utilisées au niveau de confinement (CL) 2 comme substitut pour Mtb, offrent les avantages de la sécurité et de la praticité par rapport aux mycobactéries pathogènes. Après l’infection par le BCG lux, les larves commencent à développer des structures précoces ressemblant à des granulomes, ce qui pourrait fournir un aperçu précieux du rôle de l’immunité innée dans l’établissement de l’infection tuberculeuse16. En outre, ce modèle simple d’infection des invertébrés a le potentiel de fournir une évaluation rapide, peu coûteuse et fiable de la pathogénie de tb(e) incorporant le défi contrôlé et les répétitions multiples pour la reproductibilité. En outre, le modèle a le potentiel d’être utilisé pour dépister les nouveaux médicaments antituberculeux et les candidats vaccins dans le développement précoce, réduisant le nombre global d’animaux dans l’expérimentation. La capacité de mesurer les changements dans la structure de l’hôte et des agents pathogènes, le transcriptome et le protéome pour déterminer les cibles des médicaments et évaluer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments et des vaccins thérapeutiques, sont également avantageuses.
Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux pour la préparation d’un bioluminescent M. bovis BCG lux inoculum et les larves de G. mellonella pour l’infection mycobactérienne, ainsi que la détermination des larves et mycobactériennes survie en réponse à l’infection.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation de G. mellonella comme modèle d’infection a été établie pour un certain nombre d’agents pathogènes bactériens et fongiques pour l’étude de la virulence, l’interaction hôte-pathogène, et comme un écran pour les nouvelles thérapeutiques10,22. La discussion suivante est basée sur la procédure expérimentale pour l’utilisation de G. mellonella comme modèle d’infection pour le MTBC.
La …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été soutenu par des subventions du Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC), accordées à PRL et YL (BB/P001262/1), et du National Center for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) décernée à PRL, SMN, BDR et YL (NC/R001596/1).
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
Riferimenti
- World Health Organization. . Global tuberculosis report 2018. , (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research – where is the beef?. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella – a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis – BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
