Galleria mellonella etablerades nyligen som en reproducerbar, billig och etiskt godtagbar infektions modell för mykobakteriets tuberkuloskomplex . Här beskriver vi och demonstrerar de åtgärder som vidtagits för att etablera en framgångs rik infektion av G. mellonella med bioluminiscerande Mycobacterium bovis BCG Lux.
Tuberkulos är den ledande globala orsaken till dödlighet i infektions sjukdomar och ungefär en fjärdedel av världens befolkning tros vara infekterad med Mycobacterium tuberkulos. Trots decennier av forskning, många av mekanismerna bakom framgången för M. tuberkulos som patogen organism återstår att undersökas, och utvecklingen av säkrare, effektivare antimykobakteriella läkemedel är brådskande behövs för att ta itu med ökningen och spridningen av resistent tuberkulos. Emellertid, utvecklingen av tuberkulos forskning är Flask halsar av traditionella däggdjurs infektion modeller som är dyra, tids krävande, och etiskt utmanande. Tidigare har vi etablerat larver av insekten Galleria mellonella (större vax Moth) som en roman, reproducerbar, låg kostnad, hög genom strömning och etiskt acceptabel infektions modell för medlemmar av M. tuberkulos Complex. Här beskriver vi underhåll, beredning och infektion av G. mellonella med bioluminiscerande Mycobacterium bovis BCG Lux. Med hjälp av denna infektions modell, mykobakteriell dos beroende virulens kan observeras, och en snabb avläsning av in vivo mykobakteriell börda med hjälp av bioluminescens mätningar är lätt att uppnå och reproducerbara. Även om det finns begränsningar, såsom avsaknaden av en fullt kommenterad genom för transkriptomisk analys, kan ontologisk analys mot genetiskt liknande insekter utföras. Som en låg kostnad, snabb och etiskt godtagbar modell för tuberkulos, G. mellonella kan användas som en pre-Screen för att fastställa läkemedels effekt och toxicitet, och för att fastställa jämför ande mykobakteriell virulens före användning av konventionella däggdjurs Modeller. Användningen av G. mellonella-mycobacteria modellen kommer att leda till en minskning av det stora antalet djur som för närvarande används i tuberkulos forskning.
Tuberkulos (TB) är ett stort hot mot den globala folkhälsan med 9 000 000 nya fall per år och 1 500 000 dödsfall1. Dessutom uppskattas det att en fjärdedel av världens befolkning är infekterad med sjukdomens smittämne, Mycobacterium tuberkulos (MTB). Bland den infekterade populationen kommer 5 − 10% att utveckla en aktiv TUBERKULOSSJUKDOM under deras livstid. Vidare, uppkomsten och spridningen av multiresistenta (MDR) och omfattande-Drug (XDR) resistenta MTB utgör ett allvarligt hot mot sjukdoms kontroll, med 123 länder som rapporterar minst en XDR fall1. Behandling av tbc kräver en cocktail av minst fyra anti-mykobakteriella läkemedel, av vilka Isoniazid och Rifampicin ordineras under en period av minst sex månader; behandling är ofta förknippad med komplexa biverkningar och toxiciteter. Skydd från det enda licensierade vaccinet mot tbc, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), är variabel2. En ofullständig förståelse av patogenesen av tbc hämmar kraftigt utvecklingen av nya terapeutiska och vaccinations strategier.
I årtionden djur infektion modeller har varit avgörande för TBC forskning för att förstå grundläggande patogenes och värd svar på infektion, och att utvärdera nya anti-mykobakteriella medel, immuno-Therapeutics och nya vaccin kandidater3, 4. emellertid, forskning med djur infektion modeller av tuberkulos är notoriskt svårt eftersom patogenes och progression av tuberkulos infektion är komplexa, och det finns ingen enda djur modell som imiterar hela spektrumet och viktiga egenskaper hos sjukdomen5 ,6. Dessutom är djur försök dyra, tids krävande att genomföra och kräver full etisk motivering. Ändå har djur infektions modeller av tbc beskrivits i icke-mänskliga primater (t. ex. Makaker), marsvin, kaniner, nötkreatur, svin, möss och zebra fiskar, med var och en med sina begränsningar3,4. Den murina modellen är den vanligaste modellen på grund av kostnader, till gången på inavlade linjer, reproducerbarhet av infektion och överflöd av immunologiska reagenser. Emellertid, de normalt inte bildar granulom i samband med områden av hypoxi som är karakteristiska för latent tuberkulos infektion (ltbi)6. Marsvin är mycket mottagliga för MTB -infektion, med patologi och tidig granulombildning liknande dem hos människor, och används ofta i vaccin testning; men avsaknaden av immunologiska reagenser hämmar deras användning som en infektions modell7. Zebrafish lämpar sig för storskalig screening i tidiga prekliniska studier på grund av sin ringa storlek, snabba reproduktion och avancerade genetiska verktyg, men är anatomiskt och fysiologiskt olika för människor och är endast mottagliga för Mycobacterium Marinum infektion3. De djur modeller som närmast liknar mänsklig MTB infektion är icke-mänskliga primater (t. ex. makak), men de är dyra och har betydande etiska och praktiska överväganden som avsevärt begränsar deras användning8.
Insekten larv av större vax Moth eller Honeycomb Moth, Galleria mellonella, har blivit alltmer populärt som en infektions modell för en mängd olika bakterie-och svamppatogener9, och som en skärm för nya antimikrobiella läkemedels kandidater 10. G. mellonella är en framgångs rik ryggradslösa modell på grund av dess sofistikerade medfödda immun system (bestående av cellulära och humorala försvar) som delar en hög grad av strukturell och funktionell likhet med ryggradsdjur11 . Detta inkluderar immunmekanismer såsom fagocytos av patogener av hemocyter (funktionellt liknar däggdjurs makrofag och neutrofiler)12,13, produktion och cirkulation av antimikrobiella peptider (ampere) och komplement-liknande proteiner inom hemolymfa (analogt med däggdjurs blod) av G. mellonella11. Andra fördelar9,14,15 av G. mellonella larver som modell inkluderar 1) deras stora storlek (20 − 30 mm) vilket möjliggör enkel manipulation och infektion, samt insamling av vävnad och hemolymfa för analyser, 2) enkelt underhåll vid 37 ° c, kompatibel för att studera humana patogener, 3) exakt infektion genom injektion utan behov av anestesi, 4) effekten av antimikrobiella medel kan bedömas med hjälp av mindre läkemedel för utvärdering, 5) brist på etiska begränsningar jämfört med användning av däggdjur, 6) stora grupp storlekar kan användas jämfört med djur modeller som möjliggör större reproducerbarhet, och 7) kortare tider för infektions experiment krävs.
I en färsk studie, visade vi att G. mellonella kan användas som en ny infektions modell för att studera patogenesen av infektion av bioluminiscerande M. bovis BCG Lux, en genetiskt modifierad version av vaccin stammen och medlem av MTB -komplexet (mtbc)16. Medan G. mellonella har tidigare använts som en infektions modell för icke-tuberculous mykobakterier (NTM), främst M. Marinum och Mycobacterium abscessus17,18, studier med mtbc är begränsade till som Li et al.16. Bioluminescent icke-patogena mykobakteriella stammar, som kan användas vid inne slutning nivå (CL) 2 som ett surrogat för MTB, erbjuda fördelarna med säkerhet och funktionalitet över patogena mykobakterier. Efter infektion med BCG Lux, larver börja utveckla tidiga granuloma-liknande strukturer, som skulle kunna ge värdefull inblick i den roll som medinneboende immunitet vid upprättandet av tuberkulos infektion16. Dessutom, denna enkla ryggradslösa infektions modell har potential att ge en snabb, billig och pålitlig utvärdering av TB patogenes införliva kontrollerad utmaning och flera replikat för reproducerbarhet. Dessutom har modellen potential att användas för att avskärma nya anti-TB läkemedel och vaccin kandidater i tidig utveckling, vilket minskar det totala antalet försöks djur. Förmågan att mäta förändringar i värd-och patogen struktur, transkriptome och proteom för att fastställa narkotika mål och bedöma verkningsmekanismer för nya läkemedel och terapeutiska vacciner, är också fördelaktigt.
Här beskriver vi de experimentella protokollen för beredning av en bioluminiscerande M. bovis BCG Lux inokulatet och G. mellonella larver för mykobakteriell infektion, samt bestämning av både larv och mykobakteriell överlevnad som svar på infektion.
Användning av G. mellonella som en infektions modell har fastställts för ett antal bakteriella och svamppatogener för studiet av virulens, Host-patogen interaktion, och som en skärm för nya Therapeutics10,22. Följande diskussion bygger på det experimentella förfarandet för användning av G. mellonella som en infektions modell för mtbc.
Hälsan hos de naiva larverna före experiment kan ha en avsev?…
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt stöddes av bidrag från forsknings rådet för bio teknik och biologisk vetenskap (BBSRC), som tilldelades PRL och YL (BB/P001262/1), och det nationella centret för utbyte, förfining och reduktion av djur i forskning (NC3Rs) som tilldelats PRL. SMN, BDR och YL (NC/R001596/1).
1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
Centrifuge | Any supplier | n/a | |
Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |