Dette Real-Time RT-PCR bruker dsDNA interkalering fargestoff er egnet til å diagnostisere lyssavirus infeksjoner. Metoden begynner med RNA Hentet fra rabies mistenkt ante-obduksjon eller etter obduksjon prøver, detaljering Master Mix forberedelse, RNA tillegg, oppsett av Real-Time maskin og riktig tolkning av resultatene.
Molekylær analyser er raske, følsomme og spesifikke, og har blitt sentrale for diagnostisering rabies. PCR basert analyser ha blitt anvende for tiåret å anerkjenne rabiat diagnosis bortsett fra ha bare i den seneste tid blitt akseptert av det OIE (verden Organisation for dyr sunnhet) som primære metoden å merker rabiat infeksjon. RT-PCR-analyser i sanntid gir sanntidsdata og er lukkede rørsystemer som minimerer risikoen for forurensning under konfigureringen. DNA interkalering fluorokromkonjugert Real-Time RT-PCR analyser krever ikke dyre sonder, minimere kostnaden per prøve, og når primere er utformet i bevarte regioner, analyser som er spesifikke på tvers av virus slekter heller enn spesifikke for bare ett virus arter er mulig. Her beskriver vi en pan-lyssavirus SYBR Real-Time RT-PCR-analysen som oppdager lyssaviruses over lyssavirus slekten, inkludert de mest forskjellige virusene IKOV, WCBV og LLEBV. Inne forbindelsen med dissosiasjon kurven analyse, denne analysen er følsom og spesifikk, med det fordel av oppdager alle lyssavirus art. Analysen har blitt vedtatt i mange diagnostiske laboratorier med kvalitet sikrede miljøer, slik at robust, rask, følsom diagnose av dyr og menneskelige rabies tilfeller.
Diagnostisering av rabies ved hjelp av molekylære metoder ble akseptert av OIE i 20181, erkjenner fordelene av disse teknikkene i å bekrefte rabies tilfeller, spesielt i situasjoner når prøvene er sub-optimale, eller for ante-obduksjon diagnose, idet det er nei behov for bo virus eller frisk eksemplar. PCR-analyser for lyssaviruses krever en omvendt transkripsjon (RT) før PCR kan starte som Genova er RNA. RT-PCR-analyser som oppdager 3 ‘ proksimale-regionen i Genova regnes som den mest følsomme, som transcriptional graderinger oppstår under lyssavirus replikering. Brukte RT-PCR-analyser kan deles grovt inn i to kategorier, endepunkt (eller gel-basert) og i sanntid. Begge tilnærminger er følsomme og spesifikke; men sann tids analysen har noen ekstra fordeler som å få resultater i “Real-Time” og blir utført i et helt lukket rørsystem, og dermed redusere potensialet for operatøren forurensning. Det er to viktigste tilnærminger for å oppdage lyssavirus-spesifikke amplicons innhentet ved hjelp av sanntids-analyser. Den første utnytter hydrolyse sonder (for eksempel TaqMan-sonder) som inneholder en fluoroforen og en tørste. Når sonden bindes til målområdet under forsterkning, resulterer den exonuclease aktiviteten i polymerase i dissosiasjon av fluoroforen og tørste, slik at den resulterende fluorescens måles. Den andre utnytter en DNA interkalering fargestoff (fluorokromkonjugert som SYBR Green) som binder seg til dobbelt strandet DNA under forsterkning. Den bundne fluorokromer avgir fluorescens som oppdages ved hver syklus, slik at sanntidsdeteksjon og kvantifisering av produktet. På grunn av det ikke-spesifikk art av innbindingen å alle dsDNA, en dissosiasjon kurven analyse er gjennomført å anerkjenne det spesifisitet av reaksjonen. Real-Time RT-PCRene er raske på grunn av små amplicon størrelser, vanligvis mindre enn 200 BP i lengde; men å identifisere egnede regioner for å designe primere og sonder i bevarte regioner, kan være utfordrende, derfor fjerner kravet til en sonde er en klar fordel.
En rekke Real-Time RT-PCRene har blitt designet for spesielt å oppdage individuelle stammer eller linjene av RABV2 og også å oppdage lyssaviruses over slekten3,4,5,6, 7,8,9. Alle analysene vil ha en grense på deteksjon avhengig av hvor bevart primer (og om nødvendig, sonden) sekvenser er over slekten. Faktisk, nye eller romanen virusstammer kan gjengi svært spesifikke sonde-baserte analyser ineffektiv. Valget av Real-Time deteksjon (fargestoff g. probe) vil avhenge av den tiltenkte anvendelse. For et laboratorium gjennomfører overvåking på lokalt hentet hjernen materiale og forventer høye antall negative prøver, bruk av billigere interkalering fargestoff er et fornuftig valg. Den SYBR Green tilnærmingen vil også være optimal når gjennomføre skanning overvåking der tilstedeværelsen av romanen eller avvikende lyssaviruses ville forbli uoppdaget av mer begrenset sonde-baserte analyser.
Alle medlemmer av slekten Lyssavirus forårsake sykdommen rabies, som er dødelig når symptomene vises. Det aller meste av Human og dyr rabiat sakene er på grunn av rabiat virus (RABV), det dominerende reservoar for hvilke er det hjemmemarked hunden10. Bat er viktig vert reservoarer for lyssaviruses og alle unntatt to lyssavirus arter preget har blitt identifisert direkte i ball-Ikoma lyssavirus (IKOV) og Mokola virus (MOKV)-og av disse to, har IKOV vært spekulert å ha en bat vert reservoar 11. i tillegg til de 16 anerkjente lyssavirus arter12, er det to lyssaviruses som nylig har blitt beskrevet: Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)13 og Kotalahti bat lyssavirus (KBLV)14. Lyssaviruses kan være genetisk delt inn i tre phylogroups, med flertallet av Lyssaviruses, inkludert RABV, tilhører phylogroup I. Imidlertid, de fleste avvikende lyssaviruses høre til phylogroup III og er usannsynlig å bli oppdaget av RT-PCRene beregnet på mål RABV eller phylogroup jeg virus sekvenser.
Analysen beskrevet her benytter sanntids primer pair JW12-N165, først beskrevet i 20053. Den primere ble designet for å være Pan-lyssavirus riktignok den opprinnelige søknaden var som en TaqMan analysen med sonder å differensiere lyssavirus arter. Påfølgende bekreftelse på at primer paret var Pan-lyssavirus i spesifisitet ble oppnådd utnytte en 2-trinns SYBR sanntids analysen på alle lyssavirus arter tilgjengelig, inkludert WCBV15. Primer paret er beskrevet her i en ett-trinns RT-PCR sanntids analysen utnytte en interkalering fluorokromkonjugert, validert ved hjelp av representanter fra alle 16 anerkjente lyssavirus arter. Dette ett-trinns sanntids analysen er en rask, følsom, lyssavirus-spesifikke analysen og viser at robusthet av primer satt til å identifisere selv svært avvikende lyssavirus arter.
Det gryte-lyssavirus virkelig-tid RT-PCR analysen beskrevet er en stengt-rør, ettall-steg analysen hvilke merker lyssaviruses vannrett alle tre phylogroups. Analysen har blitt validert for både dyr og menneskelig rabies diagnose, inkludert post-obduksjon hjernevev (optimalt hjernestammen), og Ante-obduksjon prøver som hud biopsi, serielt samlet spytt, eller cerebral spinalvæske (CSF). Den primere benyttes i denne analysen ble først designet og benyttet for en sonde-basert analyse for å skille mellom RABV, EBLV-1 og EBLV-23, som har vært brukt i mange OIE rabies laboratorier og utfører KONSEKVENT i EURL ferdighet ordninger. Deretter ‘ Pan-lyssavirus ‘ natur disse primere er bekreftet ved hjelp av en 2-trinns sanntids analysen15. Analysen beskrevet her har benyttet grunning å ytterligere optimalisere RT-PCR i en ett-trinns SYBR analysen muliggjør en lukket tube, rask system. Videre opplæring i rabies endemiske land som bruker denne analysen har bekreftet egnethet til å gjennomføre i ethvert laboratorium med grunnleggende PPE og kvalitetssystemer for å redusere krysskontaminering og spor prøver, fasiliteter for å lagre reagensene og en real-time maskin med SYBR-deteksjon. Analysen er ekstremt robust og har 100% korrelasjon med FAT, med forbedret følsomhet for nedbrutt prøver3. En av de viktigste fordelene for en DNA interkalering fargestoff basert analysen i forhold til en sonde basert analysen er den relative kostnaden. En ekstra fordel er at analysen bare benytter to primere, derfor er det mindre risiko for mislykket deteksjon på grunn av sekvens avvik, som har vært en svakhet i tidligere publiserte sonde-baserte analyser. Faktisk, representanter for alle lyssavirus arter (bortsett fra TWBLV og KBLV) oppdages ved hjelp av denne analysen, og sekvens analyse av TWBLV og KBLV over primer nettsteder avslører ingen vesentlige forskjeller sterkt tyder på at de vil også bli oppdaget ved hjelp Denne metoden. Rekkevidden av grensen for påvisning observert på tvers av virus analysert, kan anses å være på grunn av to viktigste faktorene. Den første er at RNA ble isolert fra klinisk hjerne materiale, derfor er mengden av Genova eksemplarer i hver ufortynnet prøve ikke direkte sammenlignbare. RNA ble “normalisert” ved å justere den totale RNA-en til 1 μg/μL; imidlertid vil andelen av viral Genova RNA innenfor denne prøven variere. Den andre er mangfoldet av lyssavirus sekvenser, til tross for primer områder som ligger i bevarte regioner, er det fortsatt posisjoner av variasjon. Derfor er det ikke overraskende at flertallet av lyssaviruses med lavere følsomhet for analysen er phylogroup II og III virus. Den dissosiasjon kurve analysen representerer en viktig parameter, minimere et falskt positivt resultat som ellers kunne oppstå på grunn av dannelsen av primer dimers, eller forsterkning av en ikke-spesifikk region i verten Genova. I realiteten er dette en sjelden forekomst og dissosiasjon kurve analysen tilsvarer å kjøre en agarose gel å visualisere riktig størrelse konvensjonelle RT-PCR amplicons. Utvalget av akseptable Tm -verdier er gitt (77-80 ° c), basert på dataene som er samlet inn i laboratoriet vårt. Det anbefales på det sterkeste at enkelte laboratorier sorterer interne data for å sikre at rekkevidden er overførbar og endrer seg deretter. Tolkning av resultatene fra både forsterkning og dissosiasjon tomter, sammen med positive og negative kontroller og ß-utgangen resultater, gir robuste og reproduserbar diagnostiske utfall.
Utenfor omfanget av denne protokollen er RNA utvinningsmetode brukt for å oppnå høy kvalitet RNA. Alle RNA analysert i denne protokollen ble utarbeidet ved hjelp TRIzol; Det er imidlertid mange egnede guanidium-baserte utdrag RNA utvinnings protokoller tilgjengelig, inkludert Kol onne-og perle BAS ert avsugs sett. Behandling av lyssavirus positive (eller mistenkte positive) prøver må være innenfor de lisensierte biosikkert-fasilitetene som er godkjent i landet. Imidlertid er den totale RNA utvunnet ikke-smittsomme, derfor håndteres i lav kontroll laboratorier. Avhengig av utvinnings metoden som brukes, må behovet for å kvantifisere og fortynne RNA vurderes. For fenol-baserte utdrag, inkludert TRIzol, er dette trinnet nødvendig og hindrer hemming av analysen fra forurensende gDNA; kolonne-og perle BAS ert utdrag (spesielt de med en fase for DNA-tømming) krever ikke fortynning før testing.
Gjennom hele protokollen, er det viktig at omsorg og flid brukes for å hindre krysskontaminering og nøyaktig tilsetning av prøven til de riktige brønnene. Et regneark med reagens beregninger og plate oppsett er tilgjengelig for nedlasting som en tilleggsfil. God laboratoriepraksis, inkludert rene arbeidsflater, regelmessige endringer av hansker, bruk av barriere spisser og forskjellige rom/UV-skap for å skille hvert trinn minimerer sjansen for forurensning. For å sikre at testen utfører med forventede parametere, må positive og negative kontroller inkluderes, og alle testprøvene kjøres i duplikat (eller tre eksemplarer).
Inkludering av kontroller er en viktig funksjon i enhver PCR, spesielt for diagnostikk. Positiv kontroll RNA ble klargjort fra CVS (Challenge virus standard) infisert mus hjerner i grupper og validert og kalibrert for å sikre konsistens mellom partiene. Kontroll RNA-en ble kvantifisert og fortynnet til 1 μg/μL. RNA, der et positivt resultat ble oppnådd i en seriell fortynning ned til minst 10-4 (lik 100 PG/μL) ble ansett som egnet for formålet. Den positive kontroll RNA-en ble lagret ved-80 ° c i 10-1 alikvoter. Ved behov ble en alikvot fortynnet 1:100 for å gi et arbeids lager ved 1 ng/μL og lagret ved-80 ° c i 5 μL alikvoter for enkel bruk. Den fortynnede positive kontrollen RNA ble brukt til å representere positive prøver på lavt nivå, og for å sikre at en eventuell reduksjon i følsomheten til analysen ble oppdaget. Et kontrollkort ble beholdt for hver kontroll for å overvåke Ct -verdiene og identifisere trender (tabell 5). Tabell 5 demonstrerte gode Inter-Run SAMMENLIGNBARHET for CVS positiv kontroll prøven Ct og tm verdier på tvers av flere dager og operatører, noe som gir trygghet for at analysen er robust og reproduserbar. Resultater som avviker fra disse målingene bør undersøkes og testprøvene gjentas om nødvendig. Molekylær karakter vann ble inkludert i hvert løp som en NTC å bekrefte at reagensene var fri for forurensning med lyssavirus RNA og bekrefte en negativ prøve. Videre, for å sikre RNA utvinnings effekt, ble ß-utgangen testet ved siden av testprøvene i et separat rør. Den lyssavirus positive kontrollen RNA ble også benyttet for den ß-utgangen positive kontrollen. Andre endogene gener eller heterologous interne kontrollsystemer kan utnyttes. Bruk av disse kontrollene sørget for at alle trinnene ble analysert under de samme betingelsene som testprøvene. Av og til, hvis prøven var svært degradert eller ikke inneholdt tilstrekkelig vert RNA (for eksempel spytt eller CSF), kan den endogene genet PCR mislykkes. I dette tilfellet, der lyssavirus i sanntid RT-PCR-resultatet var positivt, bekreftelse på en uavhengig RNA-ekstraksjon-å utelukke forurensning under RNA-ekstraksjon på den opprinnelige testen eller ved en sekundær test (enten molekylær, slik som konvensjonell RT-PCR) eller FAT. Bruk av Tabell 4 under analyse av et diagnostisk utvalg sørget for riktig tolkning.
Uten hensyn til det molekylær analysen pleide anerkjenne rabiat infeksjon, følge etter etter opp undersøkelser benytter sanger sekvensering å avgjøre lyssavirus Art og klassisk teknikker inne Virology som basin eller virus isolasjon burde likeledes være gjennomført å regne med fremme virus karakterisering og oppbacking anmeldelsen av positiv sakene å OIE og WHO.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Miss Emma Wise og Miss Megan Golding for å få hjelp til å fullføre eksperimentene. Utviklingen av denne protokollen ble økonomisk støttet av den britiske avdeling for miljø, mat og Rural Affairs (DEFRA), Scottish Government og walisisk regjering ved tilskudd [SV3500 og SE0431] og av European virus Archive Global (EVAg) prosjekt som har mottatt støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings-og innovasjonsprogram under stipend avtalen no 653316.
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |