Этот RT-PCR в реальном времени с использованием dsDNA интеркалирующего красителя подходит для диагностики лиссавирусных инфекций. Метод начинается с РНК, извлеченных из бешенства подозреваемых анте-смертных или посмертных образцов, подробно мастер подготовки смеси, РНК дополнение, установка машины в режиме реального времени и правильное толкование результатов.
Молекулярные анализы являются быстрыми, чувствительными и специфическими, и стали центральными для диагностики бешенства. ПЦР на основе анализы были использованы в течение десятилетий для подтверждения диагноза бешенства, но только недавно были приняты МЭБ (Всемирная организация по охране здоровья животных) в качестве основного метода для выявления бешенства инфекции. Анализы RT-PCR в режиме реального времени предоставляют данные в режиме реального времени и являются системами с закрытыми трубками, минимизируя риск загрязнения во время установки. ДНК интеркалирующим флюорохром в реальном времени RT-PCR анализы не требуют дорогих зондов, минимизируя стоимость образца, и когда праймеры разработаны в сохраненных регионах, анализы, которые являются специфическими для вирусов, а не специфичны только для одного вируса видов возможны. Здесь мы описываем пан-лиссавирус SYBR в режиме реального времени RT-PCR, который обнаруживает лиссавирусы по всему роду lyssavirus, в том числе наиболее различных вирусов IKOV, WCBV и LLEBV. В сочетании с анализом кривой диссоциации, этот анализ является чувствительным и конкретным, с преимуществом обнаружения всех видов лиссавируса. Этот ассеия была принята во многих диагностических лабораториях с гарантированной качеством среды, что позволяет надежной, быстрой, чувствительной диагностики случаев бешенства животных и людей.
Диагностика бешенства с использованием молекулярных методологий была принята МЭЭ в 2018году1, признавая преимущества этих методов в подтверждении случаев бешенства, особенно в ситуациях, когда образцы являются неоптимальными, или для ante-mortem диагностики, как нет необходимости в живом вирусе или свежих образцах. ПЦР-анализы на лиссавирусы требуют обратной транскрипции (РТ) до того, как ПЦР может начаться, как геном РНК. RT-PCR анализы, которые обнаруживают 3′ проксимальной области генома считаются наиболее чувствительными, как транскрипционные градиенты происходят во время репликации лиссавируса. Обычно используемые анализы RT-PCR можно разделить на две категории: конечная точка (или на основе геля) и в режиме реального времени. Оба подхода являются деликатными и специфическими; однако анализ в режиме реального времени имеет некоторые дополнительные преимущества, такие как получение результатов в “реальном времени” и проводится в полностью закрытой трубной системе, тем самым уменьшая вероятность заражения оператора. Существует два основных подхода к обнаружению ампронов, специфических лиссавирусов, полученных с помощью анализов в реальном времени. Первый использует гидролизные зонды (такие как зонды TaqMan), которые содержат фторофор и утоляющий. Когда зонд связывается с целевой областью во время усиления, экзонуклеизация деятельности полимераза приводит к диссоциации фторофора и утоления, что позволяет в результате флуоресценции, чтобы быть измерены. Второй использует ДНК интеркалирующего красителя (фторхром, таких как SYBR Green), который связывается с двойной мель ДНК во время усиления. Связанные флюорохромы испускают флуоресценцию, которая обнаруживается на каждом цикле, что позволяет в режиме реального времени обнаружения и количественной оценки продукта. В связи с неспецифическим характером связывания к какой-либо dsDNA проводится анализ кривой диссоциации для подтверждения специфики реакции. RT-PCR в реальном времени быстро из-за небольших размеров ампликона, как правило, менее 200 bp в длину; однако определение подходящих регионов для разработки грунтовок и зондов в законсервированных регионах может оказаться непростым, поэтому устранение требования к зонду является явным преимуществом.
Ряд RT-PCRs в реальном времени были разработаны специально для обнаружения отдельных штаммов или линий RABV 2, а также для обнаружения лиссавирусов по всему роду3,4,5,6, 7,8,9. Все анализы будут иметь предел обнаружения зависит от того, как сохраняется грунтовка (и, при необходимости, зонд) последовательности по всему роду. Действительно, возникающие или новые штаммы вируса могут сделать высокоспецифические анализы на основе зонда неэффективными. Выбор обнаружения в реальном времени (краситель против зонда) будет зависеть от предполагаемого приложения. Для лаборатории, осуществляющей наблюдение за местным исданным мозговым материалом и ожидающей большого количества отрицательных образцов, использование более дешевого интеркалирующего красителя является разумным выбором. Подход SYBR Green также был бы оптимальным при проведении сканирующего наблюдения, когда наличие новых или расходящихся лиссавирусов оставалось бы незамеченным более ограниченными анализами на основе зонда.
Все представители рода лиссавирус вызывают бешенство, которое приводит к летальному исходу после появления симптомов. Подавляющее большинство случаев бешенства человека и животных вызваны вирусом бешенства (RABV), доминирующим резервуаром для которого является домашняя собака10. Летучие мыши являются важными резервуарами для лиссавирусов, и все, кроме двух видов лиссавирусов, характеризуются, были выявлены непосредственно у летучих мышей – лиссавирус Икома (IKOV) и вирус Mokola (MOKV) – и из этих двух, IKOV был предположил, что у летучих мышей 11. В дополнение к 16 признанных лиссавирус видов12, Есть два лиссавирусов, которые были недавно описаны: Тайвань летучая мышь lyssavirus (TWBLV)13 и Kotalahti летучая мышь lyssavirus (KBLV)14. Лиссавирусы могут быть генетически разделены на три филогруппы, при этом большинство лиссавирусов, включая RABV, принадлежащих к филогруппе I. Однако наиболее расходящиеся лиссавирусы относятся к филогруппе III и вряд ли будут обнаружены RT-PCRs, предназначенными для таргетинга на последовательности вирусов RABV или phylogroup I.
В описанном здесь ассе используйте в режиме реального времени грунтовую пару JW12-N165, впервые описанную в 2005 году3. Праймеры были разработаны, чтобы быть пан-лиссавирус, хотя оригинальное приложение было как TaqMan асссс с зондами, чтобы дифференцировать лиссавирусвидов. Последующее подтверждение того, что первик пара была пан-лизавирус в специфике было достигнуто с использованием 2-ступенчатой SYBR в режиме реального времени асспо на всех видах лизазавирус, включая WCBV15. Первик пара описана здесь в одношаговой RT-PCR в режиме реального времени ассси с использованием интеркалирующего флюорохрома, проверенного с использованием представителей всех 16 признанных видов лизазавируса. Этот одношаговой ассея в режиме реального времени является быстрым, чувствительным, lyssavirus-специфический ассии и показывает, что надежность грунтовки установить для выявления даже весьма расходящихся лиссавирусных видов.
Пан-лиссавирус в режиме реального времени RT-PCR ассси описано закрытой трубки, один шаг ассс, который обнаруживает лиссавирусы во всех трех филогрупп. Анализ был подтвержден как для животных, так и для человека, диагностики бешенства, в том числе посмертной ткани мозга (оптимально ствол мозга), и анте-мортем образцов, таких как биопсия кожи, последовательно собранной слюны, или спинномозговой жидкости (CSF). Праймеры, используемые в этом ассее, были впервые разработаны и использованы для зонда на основе асссе, чтобы различать RABV, EBLV-1 и EBLV-23, который был использован во многих лабораториях МЭБ бешенства и последовательно выполняет в EURL махинаций мастерства. Впоследствии “пан-лиссавирус” характер этих грунтовки была подтверждена с помощью 2-шаг в режиме реального времени асссы15. В описанном здесь ассе использовался праймер для дальнейшей оптимизации RT-PCR в одноэтапном sYBR-оценке, позволяющей замкнутую трубку, быструю систему. Кроме того, обучение в эндемичных странах бешенства с использованием этого анализа подтвердило пригодность для внедрения в любой лаборатории с базовыми системами СИЗ и качества для уменьшения перекрестного загрязнения и следов образцов, средств для хранения реагентов и в режиме реального времени машина с обнаружением SYBR. Анализ является чрезвычайно надежным и имеет 100% корреляцию с FAT, с улучшенной чувствительностью для разложившихся образцов3. Одним из основных преимуществ для ДНК интеркалирования красителя на основе анализа по сравнению с зондом на основе анализа является относительная стоимость. Дополнительным преимуществом является то, что анализ использует только два грунтовки, поэтому существует меньший риск неудачного обнаружения из-за расхождения последовательности, которая была слабостью в ранее опубликованных зондных анализов. Действительно, представители всех видов лиссавирусов (кроме TWBLV и KBLV) обнаруживаются с помощью этого анализа, и анализ последовательности TWBLV и KBLV на сайтах праймера не показывает значительных расхождений, что убедительно свидетельствует о том, что они также будут обнаружены с помощью этот метод. Диапазон пределов обнаружения, наблюдаемый среди анализируемых вирусов, можно считать обусловленным двумя основными факторами. Во-первых, РНК была выделена из клинического материала мозга, поэтому количество копий генома в каждом неразбавленном образце напрямую несопоставимо. РНК была «нормализована» путем корректировки общей РНК до 1 мкг/ЗЛ; однако доля РНК вирусного генома в этой выборке будет варьироваться. Во-вторых, разнообразие последовательностей лиссавируса, несмотря на то, что грунтовые участки расположены в законсервированных регионах, остаются вариационные позиции. Поэтому неудивительно, что большинство лиссавирусов с более низкой чувствительностью к анализу являются вирусами филогруппы II и III. Анализ кривой диссоциации представляет собой важный параметр, минимизирующий ложноположительный результат, который в противном случае мог произойти из-за образования грунтовых димеров или усиления неспецифического региона в геноме хоста. В действительности, это редкое явление, и анализ кривой диссоциации эквивалентен запуску геля агарозы, чтобы визуализировать правильно по размеру обычные ампулы RT-PCR. Диапазон приемлемых значений Тм был предоставлен (77-80 градусов по Цельсию), на основе данных, собранных в нашей лаборатории. Настоятельно рекомендуется, чтобы отдельные лаборатории сопоставляют внутренние данные для обеспечения передачи диапазона и соответствующим образом вносить изменения. Интерпретация результатов как от участка усиления, так и от диссоциации, наряду с положительным и отрицательным контролем и результатами « актина», обеспечивает надежные и воспроизводимые диагностические результаты.
Вне сферы действия этого протокола находится метод извлечения РНК, используемый для получения высококачественной РНК. Вся РНК, проанализированные в этом протоколе, была подготовлена с использованием TRIzol; однако, Есть много подходящих гуанидий на основе извлечения РНК протоколы извлечения доступны, в том числе колонки и бис основе комплектов извлечения. Обработка лиссавирусных положительных (или предполагаемых положительных) проб должна осуществляться в пределах лицензированных биосодержащих средств, утвержденных в пределах страны. Тем не менее, общая добытая РНК не является инфекционной, поэтому обрабатывается в лабораториях с низким содержанием. В зависимости от используемого метода извлечения необходимо будет оценить необходимость количественной оценки и разбавления РНК. Для экстрактов на основе фенола, включая TRIzol, этот шаг необходим и предотвращает ингибирование анализа от загрязнения гДНК; однако, выдержки на основе столбцов и биса (особенно с стадиями истощения ДНК) не требуют разбавления перед тестированием.
На протяжении всего протокола, важно, чтобы уход и осмотрительность используются для предотвращения перекрестного загрязнения и точного добавления образца к правильным скважинам. Электронная таблица с расчетами реагента и макетом пластин доступен для скачивания в качестве дополнительного файла. Надувная лабораторная практика, включая чистую рабочую поверхность, регулярные изменения перчаток, использование барьерных наконечников и различных комнат/УФ-кабинетов для разделения каждого этапа, сведет к минимуму вероятность загрязнения. Для обеспечения выполнения теста с ожидаемыми параметрами необходимо включить положительные и отрицательные элементы управления и провести все тестовые образцы в дубликате (или тройном).
Включение элементов управления является важной особенностью любого ПЦР, особенно для диагностики. Позитивная контрольная РНК была подготовлена из CVS (стандарт вируса вызова) инфицированных мозгов мыши партиями и проверена и откалибрована для обеспечения согласованности между партиями. Контрольная РНК была количественно оценена и разбавлена до 1 мкг/Л. РНК, для которой положительный результат был получен в серийном разбавлении до по крайней мере 10-4 (равно 100 пг/ Л) был признан пригодным для цели. Положительный контроль РНК хранился при -80 градусов по Цельсию в 10-1 aliquots. При необходимости аликот был разбавлен 1:100, чтобы обеспечить рабочий запас при 1 нг/Л и храниться при -80 градусов по Цельсию в 5 qL одноразового использования aliquots. Разбавленная РНК положительного контроля использовалась для представления низкоуровневых положительных проб и для обеспечения того, чтобы было обнаружено любое снижение чувствительности анализа. Для каждого элемента управления была сохранена «контрольная карта» для мониторинга значений Ct и определения тенденций (таблица5). Таблица 5 продемонстрировала хорошую межранжистую сопоставимость для положительной контрольной выборки Ct и Tm значений CVS в течение нескольких дней и операторов, обеспечивая уверенность в том, что анализ является надежным и воспроизводимым. Результаты, которые отклоняются от этих измерений, должны быть исследованы и при необходимости повторять образцы. Молекулярная вода была включена в каждый запуск в качестве NTC, чтобы подтвердить, что реагенты были свободны от загрязнения лиссавирусной РНК и подтвердить отрицательный образец. Кроме того, для обеспечения эффективности извлечения РНК, «Актин» был протестирован вместе с испытательными образцами в отдельной трубке. Лиссавирусположительный контроль РНК был также использован для положительного контроля з-актина. Другие эндогенные гены или гетерологические системы внутреннего контроля могут быть использованы. Использование этих элементов управления гарантирует, что все шаги были проанализированы в тех же условиях, что и тестовые образцы. Иногда, если образец был сильно деградирован или не содержал достаточное количество РНК-хозяина (например, слюны или CSF), эндогенный ген ПЦР может выдать себя за то. В данном случае, когда результат lyssavirus в реальном времени RT-PCR был положительным, подтверждение на независимой экстракции РНК – чтобы исключить загрязнение во время извлечения РНК на исходном тесте или вторичном тесте (либо молекулярном, например, обычном RT-PCR) , или FAT. Использование таблицы 4 при анализе диагностической выборки обеспечило правильное толкование.
Независимо от молекулярного анализа, используемого для подтверждения инфекции бешенства, следить за исследованиями с помощью секвенирования Sanger для определения лиссавирусного вида и классических методов в вирусологии, таких как FAT или изоляция вируса также должны быть предприняты, чтобы позволить дальнейшей характеристики вируса и поддержка уведомления о положительных случаях МЭИ и ВОЗ.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить мисс Эмму Уайз и мисс Меган Голдинг за помощь в завершении экспериментов. Разработка этого протокола была финансово поддержана Департаментом Великобритании по окружающей среде, продовольствию и сельским делам (Defra), шотландским правительством и правительством Уэльса грантами «SV3500 и SE0431» и проектом Европейского вирусного архива (EVAg), который имеет получил финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 653316.
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |