We tonen een methode voor obductie en dissectie van muizen prostaatkanker modellen, gericht op prostaat tumor dissectie. Een stap-voor-stap protocol voor het genereren van muis prostaat tumor organoïden wordt ook gepresenteerd.
Methoden op basis van homologe recombinatie om genen te wijzigen hebben aanzienlijk bevorderd biologisch onderzoek. Genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn een strenge methode om de ontwikkeling en ziekte van zoogdieren te bestuderen. Ons laboratorium heeft verschillende GEMMs van prostaatkanker (PCa) ontwikkeld die geen expressie van één of meerdere tumor suppressor genen hebben met behulp van het sitespecifieke CRE-loxP of systeem en een prostaat-specifieke promotor. In dit artikel beschrijven we onze methode voor obductie van deze PCa GEMMs, voornamelijk gericht op dissectie van muis prostaattumoren. Nieuwe methoden die de afgelopen tien jaar zijn ontwikkeld, hebben de cultuur van epitheel afgeleide cellen vergemakkelijkt om orgel systemen in vitro in drie dimensies te modelleren. We ook detail een 3D-cel cultuur methode voor het genereren van tumor organoïden van muis PCa GEMMs. Pre-klinisch kankeronderzoek is gedomineerd door 2D celcultuur en cellijn-afgeleide of patiënt-afgeleide xenotransplantaatmodellen is modellen. Deze methoden ontbreken tumor micro Environment, een beperking van het gebruik van deze technieken in pre-klinische studies. Gemms zijn fysiologisch relevant voor het begrijpen van tumorvorming en kanker progressie. Tumor organoïde cultuur is een in vitro modelsysteem dat tumor architectuur en cellineage kenmerken aan. Bovendien, 3D-celkweek methoden zorgen voor groei van normale cellen voor vergelijking met tumor celculturen, zelden mogelijk met behulp van 2D-celkweek technieken. In combinatie heeft het gebruik van GEMMs en 3D-celcultuur in preklinische studies het potentieel om ons begrip van Kankerbiologie te verbeteren.
Sinds de late jaren 1980, de mogelijkheid om genen te veranderen door homologe recombinatie heeft sterk gevorderd de studie van biologische systemen1. Indusgebonden, weefsel-, of cel-specifieke promotor systemen en sitespecifieke recombinases, zoals CRE-loxp, heeft geavanceerde genetische studies door het faciliteren van controle over genetische modificaties zowel temporeel als ruimtelijk2,3, 4. De combinatie van deze genetische strategieën heeft een breed scala aan experimentele modelsystemen5,6,7gecreëerd.
Genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn een integraal instrument om te beoordelen hoe individuele genen of groepen van genen van invloed zijn op de ontwikkeling en ziekte van zoogdieren. In preklinisch kankeronderzoek zijn GEMMs de meest fysiologisch relevante en rigoureuze methode om kankerontwikkeling, progressie en behandeling8te bestuderen. Ons laboratorium is gespecialiseerd in het genereren en karakteriseren van kanker GEMMs.
De hoogst gediagnosticeerde niet-cutane kanker onder mannen in de Verenigde Staten is prostaatkanker (PCa). De meerderheid van de patiënten met PCa heeft een ziekte met een laag risico en een hoge overlevingskans, maar de overlevingskansen dalen drastisch wanneer ziekte wordt gediagnosticeerd in gevorderde stadia of als gerichte hormonale therapie progressie induceert naar agressieve, niet-curabele PCa subtypen9,10. Ons laboratorium heeft GEMMs ontwikkeld die gebruik maken van floxed allelen van één of meer tumor suppressor genen. Recombinatie en verlies van tumor suppressor genexpressie komt specifiek voor in de prostaat omdat we een transgen hebben geïntroduceerd met CRE of downstream van de probasin Promoter geactiveerd alleen in prostaat epitheelcellen11, 12. we hebben ook onze gemms gefokt om een CRE reporter transgen genaamd MT/mg, die induceert tomaat fluorescerende eiwit expressie in cellen ontbreekt CRE en groene fluorescerende proteïne (GFP) expressie in cellen met CRE13. Terwijl de presentatie van deze methode en onze representatieve resultaten tonen GEMMs we studeren in ons laboratorium, dit protocol kan worden gebruikt voor het genereren van prostaatkanker organoïden van elke muismodel. Echter, zoals uitvoerig besproken in onze representatieve resultaten sectie, we hebben geconstateerd dat bepaalde tumor kenmerken zijn optimaal voor prostaatkanker organoïde generatie.
In het afgelopen decennium, nieuwe methoden voor het kweken van cellen uit weefsels van epitheliale oorsprong heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons vermogen om te modelleren orgel systemen in vitro14,15. De term “3D-celcultuur” is toegeschreven aan de technieken die betrokken zijn bij het tot stand brengen en onderhouden van organoïden, die in het algemeen kunnen worden gedefinieerd als structuren die bestaan uit cellen die secundaire architectuur assembleren, aangestuurd door Orgaanspecifieke cellineage kenmerken16. Deze nieuwe methoden zijn verschillend van de klassieke 2D-celcultuur in die cellen vereisen geen transformatie of vermoralisatie voor langetermijngroei; Zo kunnen 3D-culturen van normale cellen worden vergeleken met zieke cellen. Dit is vooral waardevol bij kankeronderzoek waarbij normale celcontrole culturen meestal niet beschikbaar zijn. Daarnaast vormen organoïden spontaan secundaire weefsel architecturen met geschikte gedifferentieerde celtypen, waardoor ze een beter modelsysteem zijn om kanker in vitro te begrijpen dan 2D cellijnen17. Ons laboratorium heeft 3D organoïde lijnen gemaakt van tumor probleem geïsoleerd van onze PCA gemms om onze in vivo gegevens aan te vullen en experimenten uit te voeren die niet haalbaar zijn in gemms.
In dit artikel presenteren we geschreven en visuele protocollen voor de volledige obductie van PCa GEMMs, inclusief dissectie van verschillende muizen prostaat lobben en gemetastaseerde laesies. We beschrijven en tonen een stap-voor-stap methode voor het genereren van organoïden van muizen prostaattumoren op basis van een protocol eerder gepubliceerd door Drost et al. voor het afleiden van organoïden van normale muis prostaat epitheelweefsel18.
Kritische stappen binnen het protocol voor prostaat tumor dissectie en organoïde generatie
Verwijdering van niet-prostaatweefsel en fijne dissectie van de muis prostaat tumor is cruciaal voor de optimale generatie van kanker organoïden omdat zowel niet-prostaat epitheelcellen en normale prostaat epitheelcellen organoïden zullen genereren. Voor vaste prostaattumoren specifiek, het is cruciaal om te isoleren gebieden van levensvatbare tumor te verwijderen van besmetting met necrotisch weefsel dat het…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken het Calvin Kuo-laboratorium aan de Stanford-Universiteit voor het feit dat HEK293 cellen stabiel zijn getransventeerd met HA-Mouse Noggin-FC of HA-Mouse Rspo1-FC. We willen ook Dr. Dean Tang bedanken voor het toestaan van toegang tot de fluorescerende dissectie Microscoop in zijn laboratorium. Dit werk werd gesteund door CA179907 tot D.W.G. van het National Cancer Institute. Gedeelde bronnen bij Roswell Park uitgebreid Kankercentrum werden ondersteund door National Institutes of Health Cancer Center ondersteuning Grant CA016056.
0.25 % Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
1 1/4 in, 23 gauge, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
10 % neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
32 % paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
B27 (50X) | Gibco | 17504044 | |
Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
HEPES (1M) | Sigma | 25-060 | |
human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |