Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas
Summary
Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.
Abstract
Los esferoides tridimensionales de las células cancerosas son herramientas importantes tanto para las pruebas de análisis de drogas contra el cáncer como para obtener información mecanicista sobre la biología de las células cancerosas. El poder de esta preparación radica en su capacidad para imitar muchos aspectos de las condiciones in vivo de los tumores, al mismo tiempo que es lo suficientemente rápido, barato y versátil como para permitir un cribado relativamente alto. Las condiciones del cultivo esferoide pueden recapitular los gradientes fisicoquímicos en un tumor, incluyendo la creciente acidez extracelular, aumento de lactato, y disminución de la disponibilidad de glucosa y oxígeno, desde la periferia esferoide hasta su núcleo. Además, las propiedades mecánicas y las interacciones célula-células de los tumores in vivo son en parte imitadas por este modelo. Las propiedades específicas y, en consecuencia, las condiciones óptimas de crecimiento, de los esferoides 3D, difieren ampliamente entre diferentes tipos de células cancerosas. Además, la evaluación de la viabilidad celular y la muerte en esferoides 3D requiere métodos que difieran en parte de los empleados para cultivos 2D. Aquí describimos varios protocolos para la preparación de esferoides 3D de células cancerosas, y para el uso de estos cultivos para evaluar la viabilidad celular y la muerte en el contexto de la evaluación de la eficacia de los fármacos contra el cáncer.
Introduction
El uso de modelos de esferoides multicelulares en la biología del cáncer tiene varias décadas de edad1,2, pero ha ganado un impulso sustancial en los últimos años. En gran parte, esto refleja una mayor conciencia de cuán fuerte depende el fenotipo de las células cancerosas de su microambiente y de las condiciones específicas de crecimiento. El microambiente en tumores sólidos es fundamentalmente diferente del de los tejidos normales correspondientes. Esto incluye condiciones fisicoquímicas como pH, tensión de oxígeno, así como presión intersticial, gradientes de concentración de factores solubles como nutrientes, productos de desecho y compuestos de señalización secretados (factores de crecimiento, citoquinas). Además, incluye la organización de la matriz extracelular (ECM), las interacciones célula-célula y la señalización intercelular,y otros aspectos de la arquitectura tridimensional particular (3D) del tumor 3,4, 5,6. Las condiciones microambientales específicas en las que existen las células cancerosas afectan profundamente su perfil de expresión génica y sus propiedades funcionales, y está claro que, en comparación con el de las células cultivadas en 2D, el fenotipo de los esferoides 3D imita mucho más de cerca el de los tumores in vivo7,8,9,10,11. Los modelos 2D, incluso si emplean hipoxia, pH ácido y altas concentraciones de lactato para imitar aspectos conocidos del microambiente tumoral, todavía no capturan los gradientes de los parámetros fisicoquímicos que surgen dentro de los tumores, así como su tumor 3D Arquitectura. Por otro lado, los modelos animales son costosos, lentos y éticamente problemáticos, y en general, también tienen deficiencias en su capacidad para recapitular las condiciones tumorales humanas. En consecuencia, los esferoides 3D se han aplicado como modelo de complejidad intermedia enestudios de una amplia gama de propiedades de la mayoría de los cánceres sólidos 9,11,12,13, 14,15,16,17.
Un uso ampliamente empleado de esferoides 3D es en ensayos de detección de eficacia de la terapia contra el cáncer9,18,19,20. Las respuestas al tratamiento son particularmente sensibles al microambiente tumoral, lo que refleja tanto el impacto de la tortuosidad, la difusión restringida, la alta presión intersticial y el pH ambiental ácido en la administración de fármacos, como el impacto de la hipoxia y otros aspectos del microambiente en la respuesta a la muerte celular9,17. Debido a que el entorno dentro de los esferoides 3D desarrolla intrínsecamente todas estas propiedades7,8,9,10,11, el empleo de cultivos celulares 3D puede mejorar sustancialmente la traducción de los resultados a condiciones in vivo, sin embargo, permitir un cribado eficiente y asequible de alto rendimiento del crecimiento neto. Sin embargo, la gran mayoría de los estudios sobre la respuesta farmacológica de las células cancerosas todavía se llevan a cabo en condiciones 2D. Esto probablemente refleja que, mientras que algunos ensayos se pueden implementar relativamente fácilmente para cultivos celulares 3D, muchos, como ensayos de viabilidad, hincha occidental y análisis de inmunofluorescencia, se realizan mucho más convenientemente en 2D que en 3D.
El objetivo del presente trabajo es proporcionar ensayos fácilmente susceptibles y protocolos precisos para analizar el efecto del tratamiento con fármacos contra el cáncer en la viabilidad y supervivencia de las células cancerosas en un entorno de imitación de tumores 3D. Específicamente, proporcionamos y comparamos tres métodos diferentes para la formación de esferoides, seguidos de métodos para análisis cualitativos y cuantitativos de crecimiento, viabilidad y respuesta a fármacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de esferoides de células cancerosas 3D ha demostrado ser una herramienta valiosa y versátil no sólo para la detección de fármacos contra el cáncer, sino también para obtener información mecanicista sobre la regulación de la muerte de las células cancerosas y la viabilidad en condiciones que imitan a los del tumor Microambiente. Esto es particularmente crucial ya que la accesibilidad, la aceptación celular y los efectos intracelulares de los medicamentos quimioterápicos se ven profundamente afectados po…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Katrine Franklin Mark y Annette Bartels por su excelente asistencia técnica y a Asbjorn N-hr-Nielsen por realizar los experimentos en la Figura 1D. Este trabajo fue financiado por la Fundación Einar Willumsen, la Fundación Novo Nordisk y la Fundación Juchum (todas a SFP).
Materials
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
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