在这里, 我们提出了一个程序来量化脑损伤, 运动缺陷和神经炎症出血后, 脑出血的斑马鱼幼虫, 在人的脑出血 (ICH) 的情况下。
尽管是全球死亡率较高的中风最严重的亚型, 但没有针对脑出血 (ICH) 患者的具体治疗方法。临床上对 ICH 进行建模已被证明是困难的, 目前的啮齿类动物模型不能很好地概括人类 ICH 的自发性质。因此, 迫切需要替代临床前方法来研究 ICH 的疾病机制和潜在的药物发现。
斑马鱼的使用是一种越来越流行的转化研究方法, 主要原因是它们比哺乳动物的疾病模型具有许多优势, 包括繁殖率和允许存活的幼虫透明度成像。其他研究小组已经确定, 斑马鱼幼虫在脑血管发育的遗传或化学破坏后, 可以表现出自发的 ICH。该方法的目的是利用这些模型, 在临床前 ich 研究的背景下, 研究脑出血的病理后果。通过使用实时成像和动力检测, 可以评估和量化 ich 之后的脑损伤、神经炎症和运动功能。
本研究表明, 斑马鱼幼虫对人类脑出血的关键病理后果是保守的, 突出表明模型生物是一种有价值的体内系统, 可用于 ICH 的临床前研究。该方法的目的是使临床前中风社区能够采用斑马鱼幼虫模型作为啮齿类动物的替代补充模型系统。
脑出血 (ICH) 是与自发性脑血管破裂和出血有关的最严重的脑卒中亚型, 导致脑损伤、身体残疾和经常死亡1。尽管与 ICH2 相关的死亡率和发病率很高, 但对其基础病因和出血后病理的了解仍然缺乏。因此, 没有具体的治疗方法来预防 ICH 或改善患者的结果。我们对疾病生物学的理解大多来自于 ich3的临床前啮齿类动物模型, 然而, 到目前为止, 这些模型中的研究未能将任何成功的治疗方法转化为4,5 临床。这种失败的部分原因可能是由于这些临床前模型的一些局限性, 包括无法轻易重述人类疾病的自发性质, 以及需要侵入性手术来生成哺乳动物的模型.此外, 啮齿类动物在观察完整组织中细胞对 ICH 反应的快速发生方面也存在实际问题。鉴于缺乏啮齿类动物模型的翻译, 如果我们要克服这些实际问题并帮助确定新的药物靶点, 就必须开发自发 ICH 的替代模型。
在包括斑马鱼 (daio rerio)7在内的脊椎动物中, 血管发育的分子机制得到了很好的保护。因此, 这种模型生物体的采用正在成为研究脑血管病的一种越来越有用的力学策略.已经生成了一些斑马鱼模型, 这些模型重述了与中风相关条件9、10、11、12 相关的表型。与哺乳动物8号模型相比, 利用斑马鱼幼虫研究疾病发病机制具有实用和科学的优势.这包括高繁殖率、快速发展和幼虫透明度, 允许在没有与啮齿类动物相关的侵入性约束的情况下进行体内成像。将这些优势与斑马鱼研究社区内广泛的转基因记者线结合起来, 相当于一种强有力的体内研究疾病生物学的方法, 尚未用于病理研究ICH 的后果。
大脑对血液的损伤反应为双相 13;主要的侮辱导致神经元死亡和细胞坏死, 然后引发由先天免疫激活引起的继发性损伤波。脑损伤的第二阶段, 特别是神经炎症成分, 被认为是未来药物治疗的现实目标 13。在斑马鱼幼虫中描述了自发性和脑性出血,以前有14, 15, 16,17, 18,19。两种模型是在受精后24小时使用阿托伐他汀 (atv) 来抑制 HMGCR 途径和胆固醇生物合成14, 以及一个气泡 (bbh) 突变体, 表达在arhgef7基因β pix 中表达低纯突变,并随后抑制紧血管内连接物18的肌动蛋白重塑。这些模型表现为自发性脑特异性血管破裂在循环开始时 (~ 33 hpf)。最近, 我们进一步描述了这些模型, 以揭示脑损伤反应的关键方面是保守的人和斑马鱼幼虫20。这项研究展示了获得和可视化斑马鱼幼虫自发性脑出血所需的方法, 以及如何量化脑损伤, 以及与人类疾病有关的运动和神经炎症表型。这些数据和技术支持使用这种模型物种作为临床前 ich 研究的宝贵补充系统。
这项研究表明, 水鱼幼虫的 ICH 诱导脑损伤反应, 重述了人类状况的关键方面, 可以系统地进行检测和量化。斑马鱼提供了一个一致和可重复的自发 ich 模型, 这将有助于未来的药物干预研究, 重点是针对血液引起的脑损伤, 而不是防止血管破裂17,28.事实上, 考虑到类似于临床情况的疾病发病的快速性质, 这种方法为未来成功翻译提供了令人兴奋的前景。
斑马鱼幼虫的使用有一些局限性, 例如使用开发系统和分类等级, 但必须考虑这一模式的实际和科学优势, 以便对 ICH 提供新的见解。不需要手术就可以开始出血或监测受伤后长时间的细胞过程。斑马鱼对的高繁殖力产生容易获得和大样本大小, 由于幼虫的快速发展, 与啮齿类动物研究 29,30 相比, 实验时间线显著缩短。
目前, 这些模型适合用于阐明活完整动物大脑中自发性 ICH 的直接病理和免疫反应。有可能, 这种模式可以适应中高通量的药物屏幕的 ich 疗法, 无论是预防或恢复促进。因此, 本研究中提出的 ich 后病变是临床前 ich 研究的一个替代的补充平台。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 David Spiller 博士和曼彻斯特大学系统显微镜核心设施使用这些设备, 理查德·贝恩斯教授使用 Daynovision 和杰克·里维斯-奥蒂博士进行统计咨询。卡尔加里大学萨拉儿童博士实验室的妮可·蒙西亲切地分享了 bbh 线。我们还感谢 Stephen Renshaw 教授、Adam Hurlstone 博士、Andrew Badrock 博士和 Helen Young 博士提供的鱼线和设备。
这项研究得到了 NC3Rs (NC/N002598/1)、中风协会 (TSA LECT 2017/02)、ERA-NET NEURON (MR/M5018031) 和英国心脏基金会 (FS\ 151/67/67/67/2038) 的支持。我们还特别感谢《纳塔莉·凯特·莫斯信托基金》和曼彻斯特大学生物、医学和卫生学院的持续财政支持。
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |