כאן אנו מציגים פרוטוקול לכמת פגיעה במוח, locomotor, ודלקות נוירודלקתיות בעקבות דימום במוח בזחלים דג זברה, בהקשר של דימום גרם האדם (השייך).
למרות שהוא תת-הסוג החמור ביותר של שבץ עם התמותה הגלובלית הגבוהה, אין טיפול ספציפי לחולים עם דימום גרם (העליונה). דוגמנות הקדם קלינית הוכיחה קשה, ומודלים מכרסם הנוכחי לכידה לקוי את האופי הספונטני של האדם העצמי. לפיכך, קיימת דרישה דחופה למתודולוגיות מקדם-קליניות חלופיות לחקר מנגנוני המחלות של הארגון ולגילוי סמים פוטנציאליים.
השימוש בדגי הדגים מייצג גישה פופולרית יותר ויותר לחקר הטרנסלטיסטית, בעיקר בשל מספר יתרונות בעלי מודלים של מחלות, כולל שיעורי רבייה פורה ושקיפות זחל המאפשר לחיות דמיה. קבוצות אחרות הקימו כי הזחלים דג זברה יכול להפגין הראש הספונטנית לאחר שיבוש גנטי או כימי של פיתוח מוחי. מטרת מתודולוגיה זו היא להשתמש במודלים כאלה כדי ללמוד את ההשלכות הפתולוגיים של דימום מוחי, בהקשר של מחקר מקדם קליני. על-ידי שימוש בהדמיה חיה ובתנועתיות מוסר, נזק מוחי, דלקות נוירודלקתיות ותפקוד locomotor בעקבות השימוש באמצעות היישום, ניתן להעריך ולכמת.
מחקר זה מראה כי ההשלכות הפתולוגית מפתח של דימום המוח בבני אדם נשמרים בזחלים דג זברה הדגשת האורגניזם מודל כמו ערך במערכת vivo לחקירה טרום קלינית של ה-it. מטרת מתודולוגיה זו היא לאפשר לקהילת החתירה הקדם-קלינית להעסיק את המודל הזחל של הדג כמערכת מודל אלטרנטיבית משלימה למכרסמים.
גרם דימום (ה) הוא תת סוג חמור ביותר של שבץ הקשורים לקרע המוח הספונטנית של המוח ודימום לתוך מוביל הגורם לנזק מוחי, נכות פיזית ולעתים קרובות מוות1. למרות התמותה הגבוהה ושיעור התמותה הקשורים ל2, הבנה של האטיולוגיה התחתון והפתולוגיה שלאחר הדימום עדיין חסר. ככזה, אין טיפולים ספציפיים כדי למנוע את זה או לשפר את תוצאות המטופל. רוב ההבנה שלנו של ביולוגיה של המחלה הגיע מדגמי מכרסמים פרה-קליניים של כייך3, עם זאת מחקרים עד כה במודלים אלה לא הצליחו לתרגם כל טיפול מוצלח למרפאה4,5. כישלון זה עשוי לנבוע בחלקו, על מספר מגבלות של מודלים פרה-קליניים אלה, כולל חוסר יכולת ללכוד בקלות את האופי הספונטני של המחלה האנושית ואת הדרישה לניתוח פולשני כדי לייצר את המודלים של יונקים6. בנוסף, מכרסמים להוות בעיות מעשיות לגבי התבוננות התפרצות מהירה של תגובות הסלולר בתוך הרקמה השלמה. בהתחשב בחוסר התרגום מדגמי מכרסמים, פיתוח מודלים חלופיים של היחידה הספונטנית הוא הכרחי אם אנחנו להתגבר על הבעיות המעשיות האלה ולעזור לזהות מטרות התרופה הרומן.
המנגנונים המולקולריים של פיתוח כלי הדם נשמרים בקרב בעלי חוליות כולל בעלי-ממון (danio rerio)7. ככזה, אימוץ האורגניזם מודל זה הופך להיות אסטרטגיה מכניסטית יותר מועילה יותר עבור לימוד מחלת השדרתי8. מספר מודלים דג זברה שנוצרו אשר לכידה פנוטיפים הקשורים בתנאים הקשורים לשבץ9,10,11,12. השימוש של הזחלים דג זברה לחקור פתוגנזה מחלה מציע הן יתרונות מעשיים והן מדעיים על פני דגמי היונקים8. זה כולל שיעורי רבייה גבוהה, התפתחות מהירה ושקיפות זחל המאפשר הדמיה היפוטל ללא אילוצים פולשנית הקשורים מכרסמים. מצמד יתרונות אלה עם מגוון רחב של קווי הכתב הטרנסגניים הזמינים בתוך הקהילה המחקר דג זברה כמויות חזקות בגישה vivo לחקר ביולוגיה של המחלה, עדיין לא מנוצל לחקר פתולוגי השלכות של א. ל.
תגובת הפציעה לדם במוח היא biphasic13; העלבון העיקרי גורם מוות עצבי ונמק תא, אשר לאחר מכן יוזם גל משני של נזק הנגרמת על ידי הפעלה חיסונית מולדת. השלב השני של פגיעה במוח, במיוחד במרכיב הנוירודלקתי, נחשב יעד ריאליסטי לטיפול תרופתי בעתיד13. שטפי דם ספונטניים ומוחין מסוימים תוארו ב הזחלים דג זברה בעבר14,15,16,17,18,19. שני מודלים כאלה הם השימוש atorvastatin (טרקטורונים) ב 24 h לאחר הפריה (hpf) כדי לעכב את מסלול HMGCR וביוסינתזה כולסטרול14, ואת המוטציות (bbh) המוטציה אשר לבטא מוטציה hypomמורפית ב arhgef7 gene, βpix, ולאחר מכן מעכב אקטין שיפוץ עבור הצמתים הדוקה אנדוכלי דם18. מודלים אלה מציגים המוח הספונטנית מוחית ספציפי הקרע בדם בתחילת זרימת הדם (~ 33 hpf). לאחרונה, יש לנו לאפיין את המודלים האלה עוד כדי לגלות כי היבטים מרכזיים של התגובה לפגיעה במוח הוא שימור בין בני אדם והזחלים הדגים20. מחקר זה מדגים את המתודולוגיה הנדרשת כדי להשיג ולהמחיש דימום המוח ספונטנית של הזחלים דג זברה וכיצד לכמת את הפגיעה במוח, ו locomotor והפנוטיפים נוירודלקתיים המתייחסים למצב האנושי. הנתונים והטכניקות הללו תומכים בשימוש במינים מדגם זה כמערכת משלימה רבת ערך עבור מחקר מקדם קליני.
מחקר זה מראה כי בשנת הזחלים של הדגים בזברפיש מעורר תגובה לפגיעה במוח המהווה את ההיבטים המרכזיים של המצב האנושי שניתן להפרכה בשיטתיות ולכמת. Zebrafish מציעים מודל עקבי ומושתל של הח הספונטנית אשר תסייע עם מחקרים בעתיד התערבות הסמים התמקדו במיקוד פציעה במוח המושרה בדם, במקום למנוע קרע הספינה17,28. ואכן, בהתחשב באופי המהיר של התפרצות המחלה הדומה למצב הקליני, גישה כזו מציעה הזדמנויות מלהיבות לתרגום מוצלח בעתיד.
מספר מגבלות משויכות לשימוש בזחלים של דגי הדגים, כגון שימוש במערכת מתפתחת ובדרגת מטקמי, אך היתרונות המעשיים והמדעיים של מודל זה חייבים להיחשב לתובנות חדשות בנוגע ל. שום ניתוח אינו נדרש ליזום דימום או לנטר תהליכים סלולריים במשך פרקי זמן ארוכים לאחר הפציעה. פוריות גבוהה של זיווגים דגים ליצור בקלות ונגישים בגדלים גדולים, ובגלל התפתחות מהירה של הזחלים ציר הזמן ניסיוני מופחת באופן משמעותי לעומת מחקרים מכרסמים29,30.
כיום, המודלים האלה מתאימים להסבר מיידי להבעת התגובה הפתולוגית והחיסונית המיידית לתוך המוח הספונטני במוחו של חיות שלמות. באופן פוטנציאלי, מודל זה יכול להיות מותאם עבור מסכי סמים בינונית-גבוהה התפוקה עבור טיפולים בנושא, אם מניעה או שחזור קידום. ככזה, הפתווגיות פוסט-האלה שהוצגו במחקר זה מייצגים פלטפורמה חלופית, משלימה עבור מחקר ה-it קליני מראש.
The authors have nothing to disclose.
ברצוני להודות לד ר דוד ספילר ולמרכז הליבה של מיקרוסקופ מערכות של אוניברסיטת מנצ לשימוש בציוד, פרופ ‘ ריצ’רד ביינס לשימוש ב דניאוז’ן וד ר ג’ק ריברס-אאוטי להתייעצות סטטיסטית. הקו צאתן שיתף באדיבות ניקול munsie מן המעבדה של ד ר שרה הילד באוניברסיטת קלגרי. אנו מודים גם לפרופ ‘ סטפן רנשו, ד ר אדם הורסטון, ד ר אנדרו בדרוק וד ר הלן יאנג לקווי דגים וציוד.
מחקר זה היה נתמך על ידי NC3Rs (NC/N002598/1), האגודה לשבץ (2017/02 השמש LECT), ERA-NET עצב (מר/M501803/1) ואת קרן הלב הבריטי (FS/15/67/32038). אנחנו גם אסירי תודה במיוחד לקרן נטלי קייט מוס והפקולטה לביולוגיה של אוניברסיטת מנצ, רפואה ובריאות עבור המשך התמיכה הכספית שלהם.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |