여기에서 우리는 인간의 뇌 내 출혈 (ICH)의 맥락에서, 제 브라 피쉬 애벌레에 있는 두뇌에 있는 출혈 뒤에 뇌 손상, 운동 적자 및 신경 염증을 정량화 하는 프로토콜을 제시 합니다.
높은 글로벌 사망률을 가진 치기의 가장 가혹한 특수형 임에도 불구 하 고, 뇌 내 출혈 (ICH)를 가진 환자를 위한 특별 한 처리는 없습니다. 무형 유산 모델링 사전-임상적으로는 어려운 것으로 입증 되었으며, 현재 설치류 모델은 인간의 ICH의 자발적인 본질을 제대로 탈환 하 고 있다. 따라서 무형 유산의 질병 기전을 연구 하 고 잠재적인 신약 발견을 위한 대체 전 임상 방법론에 대 한 긴급 한 요구 사항이 있다.
Zebrafish의 사용은 주로 질병의 포유류 모델을 통해 소유 하 고 있는 다 수의 장점으로 인해 번역 연구에 대 한 점점 더 인기 있는 접근법을 나타내며, 다양 한 재생 속도와 애벌레 투명성을 포함 하 여 살아있는 이미징. 다른 집단은 제 브라 피쉬 애벌레가 뇌혈관 발달의 유전 적 또는 화학적 파괴를 따르는 자발적인 무형 유산을 전시할 수 있다는 것을 확립 했습니다. 이 방법론의 목적은 임상 전 무형 유산 연구의 맥락에서 뇌 출혈의 병리학 적 결과를 연구 하기 위해 이러한 모델을 활용 하는 것입니다. 살아있는 화상 진 찰 및 운동 성 분석을 사용 하 여, 뇌 손상, 신경 염증 및 무형 문화 유산 후 기능을 평가 하 고 정량화 할 수 있습니다 운동.
이 연구는 인 간에 있는 뇌 출혈의 주요 병리학 적 결과는 무형 문화 유산의 전 임상 조사를 위한 중요 한 생체 내 시스템으로 모델 유기 체를 강조 하는 zebrafish 애벌레에 보존 되어 있음을 보여준다. 이 방법론의 목적은 제 브라 피시 애벌레 모델을 설치류에 대 한 대체 보완 모델 시스템으로 사용 하기 위해 전 임상 뇌졸중 커뮤니티를 활성화 하는 것입니다.
뇌 내 출혈 (ICH)은 자발적인 대뇌 혈관 파열과 관련 되었던 치기의 가장 가혹한 하위 유형 및 뇌 손상, 신체 장애 및 수시로 죽음1에 지도 하는 실질로 출혈입니다. 무형 유산2와 관련 된 높은 사망률 및 발병 률에도 불구 하 고, 언더 피닝 병 인 및 출혈 후 병리학의 이해는 여전히 결여 되어 있다. 따라서, 무형 유산을 예방 하거나 환자 결과를 개선 하기 위한 특별 한 치료법이 없습니다. 질병 생물학에 대 한 우리의 이해의 대부분은 ICH의 전 임상 설치류 모델에서 왔다3, 그러나 연구-이 모델에서 날짜는 클리닉에 어떤 성공적인 치료를 번역 하지 못했습니다4,5. 이 실패는 부분적으로, 포유류에서 모형을 생성 하는 침략 적인 수술을 위한 인간적 인 질병 및 요구 사항의 자발적인 본질을 쉽게 탈환 하는 무 능력을 포함 하 여, 이들 전 임상 모델의 몇몇 한계에 기인 할 수 있다6. 또한, 설치류는 온전한 조직에서 무형 유산에 대 한 세포 반응의 급속 한 발병을 관찰 하는 것과 관련 하 여 실질적인 문제를 제기 한다. 설치류 모델에서 번역의 부족을 감안할 때, 자연 무형의 대체 모델을 개발 하는 것은 우리가 이러한 실제적인 문제를 극복 하 고 새로운 약물 표적을 식별 하는 데 도움이 되는 경우에 필수적 이다.
혈관 발달의 분자 기전은 제 브라 피시 (danio 재기록)7을 포함 하 여 척추 동물 사이에서 잘 보존 됩니다. 이와 같이,이 모형 유기 체의 채택은 뇌혈관 질환8을 공부 하기를 위한 지금까지 더 유용한 기계화 전략이 되 고 있습니다. 뇌졸중 관련 조건9, 10,12와 관련 된 표현 형을 탈환 하는 다양 한 zebrafish 모델이 생성 되었습니다. 질병 병 인을 조사 하기 위해 zebrafish 애벌레의 사용은 포유류 모델8보다 실용적이 고 과학적인 이점을 제공 합니다. 여기에는 설치류와 관련 된 침 습 적 제약 없이 생체 내 이미징이 가능한 높은 재생 속도, 급속 한 개발 및 애벌레 투명성이 포함 됩니다. 이러한 장점을 다양 한 유전자 변형 리포터 라인과 결합 하 여 제 브라 피시 연구 공동체 내에서 사용할 수 있는 것은 질병 생물학을 연구 하기 위한 강력한 생체 내 접근법으로 서, 아직 병리학 적 연구에 활용 되지 이는 무형 유산의 결과 이다.
뇌의 혈액에 대 한 부상 반응은 복 상13; 1 차적인 모욕은 선천적인 면역 활성화에 의해 유도 되는 손상의 이차 물결을 시작 하는 신경 죽음과 세포 괴 사를 일으키는 원인이 됩니다. 뇌 손상, 특히 신경 염증 성분의 두 번째 단계는 미래의 약물 치료13에 대 한 현실적인 대상으로 간주 됩니다. 자발적 및 대뇌 특이 적 출혈는 제 브라 피시 애벌레에 앞서14,15,16,17,18에 기술 되었다. 이러한 두 가지 모델은 HMGCR 통로 및 콜레스테롤 생 합성14를 저해 하는 24 시간 후 시비 (hpf)에서 아 토르 바 스타 틴 (ATV)을 사용 하 고, arhgef7 유전자에서의 저 혈당 돌연변이를 발현 하는 버블 헤드 (bbh) 돌연변이, β 픽스, 이어서 단단한 혈관 내 접합부에 대 한 액 틴 리 모델링을 억제 한다 (18). 이 모형은 순환의 개시에서 자발적인 대뇌 특정 혈관 파열을 전시 합니다 (~ 33 hpf). 최근, 우리는 뇌 손상 반응의 주요 측면이 인간과 zebrafish 애벌레 (20) 사이에 보존 되는 것을 공개 하기 위해 이러한 모델을 특징으로 한다. 이 연구는 zebrafish 애벌레에 있는 자발적인 두뇌 출혈 및 뇌 손상을 정량화 하는 방법, 그리고 인간 상태와 관련 있는 운동 및 신경 염증 표현 형을 획득 하 고 시각화 하는 데 필요한 방법론을 보여줍니다. 이러한 데이터 및 기술은 임상 전 무형 유산 연구를 위한 가치 있는 보완적인 시스템으로 서이 모델 종의 사용을 지원 한다.
이 연구는 zebrafish 애벌레에 있는 ICH가 체계적으로 해석 되 고 정량화 될 수 있는 인간적 인 조건의 중요 한 측면을 탈환 하는 뇌 손상 반응을 유도 한다는 것을 보여줍니다. Zebrafish는 자발적 무형의 일관 되 고 재현성 있는 모델을 제공 하 여 혈관 파열을 방지 하기 보다는 혈액 유발 뇌 손상을 대상으로 하는 데 초점을 맞춘 미래의 약물 개입 연구를 지원 합니다17,28. 실제로, 임상 상황과 유사한 질병 발병의 급속 한 본질을 감안할 때, 그러한 접근법은 미래에 성공적인 번역을 위한 흥미로운 전망을 제공 합니다.
일부 제한은 개발 시스템 및 분류 계급의 사용과 같은 zebrafish 애벌레의 사용과 관련 되어 있지만,이 모델의 실용적이 고 과학적인 이점은 무형 유산에 대 한 새로운 통찰을 제공 하는 것으로 간주 되어야 한다. 수술은 시 술을 시작 하거나 부상 후 시간의 연장 된 기간 동안 세포 과정을 모니터링 할 필요가 없습니다. 제 브라 피시 페어링의 높은 체 내는 쉽게 접근 가능 하 고 큰 샘플 크기를 생성 하며, 애벌레의 빠른 발달로 인해 설치류 연구29,30에 비해 실험적 타임 라인이 현저히 감소 하였다.
현재이 모형은 살아있는 본래 동물의 두뇌에 있는 자발적인 무형 유산에 즉각 병리학 적이 고 면역학 반응을 해명 하기를 위해 사용 하기 위하여 적합 합니다. 잠재적으로,이 모델은 예방 또는 회복 촉진 여부에 관계 없이 무형 유산 요법을 위한 중간 정도의 높은 처리량의 약물 스크리닝에 적합 합니다. 이와 같이,이 연구에 제시 된 사후 무형 병 리는 전 임상 무형 유산 연구를 위한 대안적이 고 보완적인 플랫폼을 나타낸다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 박사 데이비드 스 패 러와 장비 사용을 위한 맨체스터 대학교 시스템 현미경 검사의 핵심 시설에 감사 하 고 싶습니다, 교수 리처드 바인 DanioVision 및 닥터 잭 리버스-Auty의 사용에 대 한 통계 상담. Bbh 라인은 친절 하 게 캘거리 대학의 사라 아이의 실험실에서 니콜 Munsie에 의해 공유 되었다. 우리는 또한 스티븐 렌 쇼 박사, 아담 후르 스톤 박사의 닥터 앤드류 배드 록 박사와 헬렌 영 박사에 게 물고기 라인과 장비에 대 한 감사를 드립니다.
본 연구는 NC3Rs에 의해 지지 되었다 (NC/N002598), 뇌졸중 협회 (TSA LECT 2017/02) 및 영국 심장 재단 (MR/M501803)과 영국의 하트 파운데이션. 우리는 또한 그들의 지속적인 재정 지원을 위한 나탈리 케이트 모스 신탁 및 맨체스터 대학교 생물학 학부, 의학 및 건강에 특히 감사 하 고 있습니다.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |