Здесь мы представляем протокол для количественной оценки черепно-мозговой травмы, локомотивных дефицитов и нейровоспаления после кровотечения в мозге в личинки зебры, в контексте внутримозгового кровоизлияния человека (ICH).
Несмотря на то, что это самый тяжелый подтип инсульта с высокой глобальной смертностью, специфического лечения для пациентов с внутримозговым кровоизлиянием (Ich). Моделирование ICH до клинически оказалось трудным, и нынешние модели грызунов плохо резюмировать спонтанную природу человека ICH. Поэтому существует настоятельная необходимость в альтернативных доклинических методологиях для изучения механизмов заболевания в МКЗ и для потенциального открытия препарата.
Использование зебры представляет собой все более популярный подход к трансляционным исследованиям, в первую очередь из-за ряда преимуществ, которыми они обладают над моделями болезней млекопитающих, включая плодовитые показатели воспроизводства и прозрачность личинок, позволяющие жить изображения. Другие группы установили, что личинки зебры могут проявлять спонтанный ICH после генетического или химического нарушения цереброваскулярного развития. Цель этой методологии заключается в использовании таких моделей для изучения патологических последствий кровоизлияния в мозг, в контексте доклинических исследований ICH. С помощью живой визуализации и подвижности анализы, повреждение мозга, нейровоспаление и локомотивная функция после ICH могут быть оценены и количественно.
Это исследование показывает, что ключевые патологические последствия кровоизлияния в мозг у человека сохраняются в личинках зебры, подчеркивая модель организма как ценную систему in vivo для доклинического исследования ICH. Цель этой методологии заключается в том, чтобы дать возможность сообществу, доклиническим инсультам, использовать модель личинок зебры в качестве альтернативной дополнительной модели системы для грызунов.
Внутримозговое кровоизлияние (ICH) является наиболее тяжелым подтипом инсульта, связанного с спонтанным разрывом сосуда головного мозга и кровотечением в паренхиму, приводящим к повреждению мозга, физической инвалидности и часто йен1. Несмотря на высокую смертность и заболеваемость, связанную с ICH2,понимание лежащей в основе этиологии и патологии после кровоизлияния по-прежнему отсутствует. Как таковой, Есть никаких конкретных методов лечения для предотвращения ICH или улучшить исходы пациента. Большая часть нашего понимания биологии болезни пришла из доклинических моделей грызунов ICH3, однако исследования на сегодняшний день в этих моделях не удалось перевести какой-либо успешной терапии в клинику4,5. Эта неудача может быть отчасти связано с некоторыми ограничениями этих доклинических моделей, в том числе неспособность легко резюмировать спонтанный характер болезни человека и требование для инвазивной хирургии для создания моделей у млекопитающих6. Кроме того, грызуны создают практические проблемы в отношении наблюдения быстрого начала клеточных реакций на ICH в нетронутой ткани. Учитывая отсутствие перевода с моделей грызунов, разработка альтернативных моделей спонтанного ICH необходимо, если мы хотим преодолеть эти практические проблемы и помочь определить новые цели наркотиков.
Молекулярные механизмы развития сосудов хорошо сохраняются среди позвоночных, включая зебры(Danio rerio)7. Таким образом, принятие этой модели организма становится все более полезной механистической стратегии для изучения цереброваскулярных заболеваний8. Ряд моделей зебры были созданы, которые повторяют фенотипы, связанные с инсультом связанных условий9,10,11,12. Использование личинок зебры для исследования болезни патогенеза предлагает как практические, так и научные преимущества по сравнению с моделями млекопитающих8. Это включает в себя высокие показатели воспроизводства, быстрое развитие и прозрачность личинок, что позволяет для интравитентной визуализации без инвазивных ограничений, связанных с грызунами. Соединение этих преимуществ с широким спектром трансгенных линий репортера, доступных в рамках научно-исследовательского сообщества зебры, составляет мощный подход in vivo для изучения биологии болезней, еще не использованный для изучения патологических последствия ICH.
Ответ травмы на кровь в головном мозге является двухфамным13; первичное оскорбление вызывает гибель нейронов и некроз клеток, который затем инициирует вторичную волну повреждений, которая вызвана врожденной иммунной активацией. Вторая фаза черепно-мозговой травмы, в частности нейровоспалительный компонент, считается реалистичной мишенью для будущего лечения наркотиков13. Спонтанные и церебральных конкретных кровоизлияний были описаны в личинки зебры ранее14,15,16,17,18,19. Две такие модели являются использование аторвастатина (ATV) на 24 ч после оплодотворения (hpf) для ингибирования пути HMGCR и холестерина биосинтеза14, и пузырь (bbh) мутант, которые выражают гипоморфные мутации в гене arhgef7, и впоследствии ингибирует актин ремоделирования для плотных эндоваскулярных узлов18. Эти модели демонстрируют спонтанный разрыв мозгового сосуда в начале кровообращения (33 л.с.). В последнее время мы охарактеризовали эти модели далее, чтобы показать, что ключевые аспекты реакции травмы головного мозга сохраняется между людьми и личинки зебры20. Это исследование демонстрирует методологию, необходимую для получения и визуализации спонтанных кровоизлияний в мозг в личинки зебры и как количественно травмы головного мозга, а также локомотиви и нейровоспалительные фенотипы, которые относятся к человеческому состоянию. Эти данные и методы поддерживают использование этого модельного вида в качестве ценной дополнительной системы для доклинических исследований ICH.
Это исследование показывает, что ICH в личинки зебры вызывает ответ травмы головного мозга, что резюмирует ключевые аспекты человеческого состояния, которые могут быть систематически анализируется и количественно. Зебрафиш предлагают последовательную и воспроизводимую модель спонтанного ICH, который поможет с будущими исследованиями вмешательства наркотиков сосредоточены на ориентации кровотока индуцированной черепно-мозговой травмы, а не предотвращение разрыва сосуда17,28. Действительно, учитывая быстрый характер заболевания, сродни клинической ситуации, такой подход открывает захватывающие перспективы для успешного перевода в будущем.
Некоторые ограничения связаны с использованием личинок зебры, таких как использование развивающейся системы и таксономического ранга, однако практические и научные преимущества этой модели должны быть рассмотрены, чтобы предложить новые идеи в ICH. Никакая операция не требуется, чтобы инициировать кровотечение или контролировать клеточные процессы в течение длительных периодов времени после травмы. Высокая плодовитость спаривания зебры генерирует легкодоступные и большие размеры образцов, а благодаря быстрому развитию личинок экспериментальная хронология значительно снижается по сравнению с исследованиями грызунов29,30.
В настоящее время эти модели пригодны для использования для выяснения непосредственной патологической и иммунологической реакции на спонтанный ICH в мозге живых нетронутых животных. Потенциально, эта модель может быть адаптирована для средне-высокой пропускной связи наркотиков экраны для ICH терапии, будь то профилактические или восстановления содействия. Таким образом, патологии пост-ICH, представленные в данном исследовании, представляют собой альтернативную, дополняемую платформу для доклинических исследований ICH.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дэвида Спиллера и Основной фонд микроскопии Манчестерского университета за использование оборудования, профессора Ричарда Бейнса за использование DanioVision и д-ра Джека Риверса-Аути для статистической консультации. Линия bbh была любезно разделена Николь Мунси из лаборатории доктора Сары Чайлд в Университете Калгари. Мы также благодарим профессора Стивена Реншоу, д-ра Адама Херлстоуна, д-ра Эндрю Бадрока и д-ра Хелен Янг за рыбные линии и оборудование.
Это исследование было поддержано NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (MR/M501803/1) и Британским фондом сердца (FS/15/67/32038). Мы также особенно благодарны Фонду Натали Кейт Мосс и факультету биологии, медицины и здравоохранения Манчестерского университета за их постоянную финансовую поддержку.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |