En roman prøveholder til makromolekylær røntgenkrystallografi sammen med en passende håndterings protokol præsenteres. Systemet giver krystalvækst, krystal iblødsætning og in situ diffraktion dataindsamling på både omgivende og kryogen temperatur uden behov for nogen krystal manipulation eller montering.
Macromolekylære X-ray krystallografi (MX) er den mest fremtrædende metode til at opnå høj opløsning tredimensionel viden om biologiske makromolekyler. En forudsætning for metoden er, at højt bestilt krystallinsk præparat skal dyrkes fra det makromolekyle, der skal undersøgt, og som derefter skal forberedes til diffraktion-eksperimentet. Denne forberedelse procedure typisk indebærer fjernelse af krystal fra opløsningen, hvor det blev dyrket, iblødsætning af krystal i ligand opløsning eller Cryo-protectant løsning og derefter immobilisering af krystal på en mount egnet til eksperimentet. Et alvorligt problem for denne procedure er, at makromolekylære krystaller ofte er mekanisk ustabile og temmelig skrøbelige. Derfor kan håndteringen af sådanne skrøbelige krystaller let blive en flaskehals i et forsøg på at bestemme strukturen. Enhver mekanisk kraft, der påføres sådanne sarte krystaller kan forstyrre den almindelige pakning af molekyler og kan føre til et tab af diffraktion effekt af krystaller. Her præsenterer vi en roman alt-i-én prøve indehaver, som er blevet udviklet med henblik på at minimere håndteringen trin af krystaller og dermed at maksimere succesraten af strukturen beslutsomhed eksperiment. Prøveholderen understøtter opsætningen af krystal dråber ved at udskifte de almindeligt anvendte mikroskop dæksedler. Desuden giver det mulighed for in-Place krystal manipulation såsom ligand iblødsætning, kryo-beskyttelse og kompleksdannelse uden åbning af krystalliserings hulen og uden krystal håndtering. Endelig er prøveholderen konstrueret med henblik på at muliggøre indsamlingen af in situ-røntgen diffraktion-data ved både omgivende og kryogen temperatur. Ved at bruge denne prøveholder er chancerne for at beskadige Krystallen på vej fra krystallisering til diffraktion dataindsamling betydeligt reduceret, da direkte krystal håndtering ikke længere er påkrævet.
Kendskabet til den tredimensionale struktur af biologiske makromolekyler udgør en vigtig hjørnesten i al grundlæggende biologisk, biokemisk og biomedicinsk forskning. Dette endda strækker sig til visse translationelle aspekter af en sådan forskning, såsom for eksempel narkotika opdagelse. Blandt alle metoder til opnåelse af sådanne tredimensionale oplysninger ved atomar opløsning X-ray krystallografi er den mest magtfulde og mest fremtrædende en, som det fremgår af det faktum, at 90% af alle tilgængelige strukturelle oplysninger er bidraget af X-ray krystallografi1. Den vigtigste forudsætning for røntgenkrystallografi, som samtidig er dens største begrænsning, er, at diffraktion-kvalitet krystaller skal produceres og forberedes til diffraktion eksperiment. Dette skridt er stadig en af de største flaskehalse i metoden.
Historisk set, diffraktion data fra protein krystaller blev indsamlet ved omgivelsestemperatur. Individuelle krystaller blev omhyggeligt overført til glas eller kvarts kapillærer forud for dataindsamlingen, Moder væske blev føjet til kapillærer, således at krystallerne ikke ville tørre ud og kapillærer blev forseglet2,3, 4. for at Siden 1980 ‘ erne, blev det mere og mere klart, at på grund af de ioniserende egenskaber af X-stråling og den overhængende stråling følsomhed af makromolekylære krystaller, dataindsamling ved omgivelsestemperatur udgør alvorlige begrænsninger på metoden. Derfor blev der udviklet tilgange til at afbøde strålingsskader effekter ved at køle makromolekylære krystaller ned til 100 K og til at indsamle diffraktion data ved så lav temperatur5,6. Til arbejde ved lave temperaturer blev montage af prøverne i kapillærer upraktisk på grund af den lave varme overføringshastighed. På trods af dette, er der løbende bestræbelser på også at bruge kapillærer, især fra kontra diffusion krystalliserings forsøg, for lav-temperatur diffraktion arbejde7,8, men uanset det, blev det standard tilgang i makromolekylær krystallografi til at montere makromolekylære krystaller, der indehaves af en tynd film af moder væske inde i en tynd kablet sløjfe9,10. Selv om en række forbedringer (f. eks. indførelsen af litografiske sløjfer og lignende strukturer11) er blevet gjort over tid til denne loop-baseret montering, de grundlæggende principper, der blev udviklet i begyndelsen af 1990 ‘ erne er stadig i brug i dag. Det kan sikkert siges, at de fleste diffraktion datasamlinger på makromolekylære krystaller i dag stadig stole på denne tilgang5.
Over tid, der var nogle interessante nye udviklinger og ændringer af loop-baserede monteringsmetode, men disse tilgange er hidtil ikke blevet bredt vedtaget i samfundet. Den ene er den såkaldte loop-less montering af krystaller, som blev udviklet for at opnå lavere baggrunds spredning12,13,14. En anden er brugen af Graphene skeder at wrap de krystallinske prøver og beskytte dem mod udtørring. Graphene er et velegnet materiale i denne henseende på grund af sin meget lave røntgen spredning baggrund15.
På det seneste er udviklingen inden for prøve mounts hovedsagelig fokuseret på at standardisere beslagene med det formål at øge prøvehastigheden16 eller på at designe mounts, som kan indeholde mere end én prøve17, f. eks. mønstrede membraner på en Silicon frame, som er i stand til at holde hundredvis af små krystaller mest inden for seriel krystallografi18,19,20,21,22.
Alle de hidtidige prøve monteringsmetoder kræver stadig en vis grad af manuel indgriben, hvilket betyder, at der er en iboende fare for at forårsage mekanisk beskadigelse af prøven. Derfor er nye tilgange er ved at blive søgt ved ingeniør prøvemiljø sådan, at diffraktion data af krystaller kan indsamles i deres vækst miljø. En sådan metode er betegnet in situ eller plade-screening23,24 og det er allerede implementeret på en række makromolekylære krystallografi acceleratorens på forskellige Synchrotron kilder på verdensplan25. Anvendelsen af denne metode er dog begrænset af krystal pladens geometriske parametre og den plads, der er til rådighed omkring instrumentets prøvepunkt.
Endnu en tilgang er realiseret i det såkaldte CrystalDirect-system26. Her høstes hele krystalliserings dråber automatisk. De folier, hvor krystallerne er blevet dyrket, er brugerdefinerede-cut ved hjælp af en laser og anvendes direkte som prøveholderen27.
I det arbejde, der er beskrevet her, var målet at udvikle en prøveholder, som ville gøre det muligt for en bruger at flytte den krystallinske prøve fra sit vækstkammer til dataindsamlings anordningen uden at røre ved den, og som ville gøre det let for brugeren at manipulere prøven. Da mange forskere inden for makromolekylær krystallografi stadig bruger 24-brønd krystalliserings formatet til optimering af krystalvækst ved at ændre de betingelser, der er identificeret i store Screenings kampagner, er den nye prøve indehaver designet til at være kompatibelt med dette format. I det følgende beskrives udformningen af den nye prøveholder, og prøve indehaverens håndtering og ydeevne i forbindelse med in situ-dataindsamling og ligand-iblødsætning vil blive påvist. Endelig vil egnetheden af denne nye prøve indehaver og dens begrænsninger for de forskellige arbejdstrin blive diskuteret.
Egnethed til forsøg med krystallisering. De nye prøveholdere kan anvendes til standard forsøg med hængende drop krystallisering ved hjælp af enten 24-Well Linbro type plader (type 1 og 2) eller 24-brønd SBS footprint plader, hvor hver brønd har en diameter på 18 mm (3). De kan bruges i stedet for standard mikroskop dæksedlerne. Den amorfe COC folie sikrer lufttæthed af systemet. Overvågningen af krystalliserings forsøget er mulig ved hjælp af et transmissions-lys mikroskop, på grund af brugen af høj klarhed Foils. Efter vores bedste overbevisning findes der ingen andre prøveholdere til 24-brønd krystalliserings plader, hvilket ville tillade krystal manipulation eller diffraktion eksperimenter uden mekanisk at fjerne Krystallen fra faldet, hvor det dyrkes. Dette er af særlig betydning, da mange forskere på området stadig er afhængige af sådanne plader til krystal optimering, på grund af det faktum, at større drop mængder kan bruges sammenlignet med 96-godt siddende-drop plader. Med disse større drop mængder, kan større krystaller opnås.
Egnethed til krystal manipulation. På grund af de selvhelbredende egenskaber af den ydre COC folie og den mikroporøse struktur af den indre gule polyimid folie, er krystal miljøet tilgængeligt, og krystallerne kan manipuleres uden mekanisk at overføre dem til andre beholdere. Dette gør prøve holderne meget bekvemt. Det eneste andet system, vi kender til, som tillader denne indirekte og blid adgang til Krystallen, er CrystalDirect-systemet26. CrystalDirect er dog mindre fleksibel, da der skal anvendes særlige 96-brønd krystalliserings plader. Folien, hvor krystallerne vokser, er den samme, der forsegler krystalliserings eksperimentet, og det er ikke selv heling. Det betyder, at en blænde, der er blevet gennemboret i folien ved laser ablation for ligand eller Cryo-protectant levering til krystallerne vil forblive åben, hvilket øger chancen for flydende fordampning. Dette er i modsætning til vores design, hvor krystaller ikke vil være direkte udsat for miljøet, selv om COC folie bliver gennemboret et antal gange.
Egnethed til in situ diffraktion eksperimenter ved omgivelsestemperatur. Prøveholderen kan fjernes fra krystalliserings pladen på en lineær måde, fastgjort på en magnetisk base og sat på et beamline goniometer. For en diffraktion eksperiment ved stuetemperatur, er det tilrådeligt at sætte prøven i en luftstrøm af defineret luftfugtighed33. Moder væsken omkring Krystallen kan fjernes, inden prøveholderen sættes på goniometeret for at reducere baggrunds spredningen. En sådan set-up er stabil i timevis.
Det anvendte materiales egnethed til drift og opbevaring ved 100 K. Hverken det materiale, der anvendes til fremstilling af prøveholderen eller polyimid-filmen, påvirkes negativt ved at nedkøle dem til lave temperaturer34. Derfor udgør arbejdet med prøveholderen ved lav temperatur (f. eks. 100 K) ikke et alvorligt problem.
Egnethed til in situ diffraktion eksperimenter ved 100 K. For dataindsamling ved 100 K i en nitrogenstrøm skal prøveholderen fjernes fra krystalliserings pladen som i det foregående afsnit, fastgjort på en magnetisk base og sat i en gasformigt nitrogenstrøm ved 100 K på et beamline goniometer. Hvis det ønskes, kan prøven også være Cryo-beskyttet, selv om det er sandsynligt, at for nøgne prøver dette ikke kan være nødvendigt i de fleste tilfælde31. Til forsøg ved 100 K er prøve holderne type 2 og 3 bedre egnet, fordi den udvendige plastik ring kan fjernes. Derfor, de er af mindre størrelse og bør således være mindre tilbøjelige til at glasur. Dog kan selv en prøve indehaver af type 1 anvendes. Givet en ikke for høj luftfugtighed i den eksperimentelle Hutch og en korrekt justeret kryo-system glasur op af holderen er ikke rigtig et problem.
Begrænsninger. Prøveholderens geometri muliggør uhindret diffraktion dataindsamling ved rotations metoden over et samlet rotations område på 160 °. Dette er tilstrækkeligt, således at komplette diffraktion datasæt kan opnås for de fleste krystal systemer. I tilfælde, hvor dette ikke er muligt, skal data fra mere end krystal samles. Når krystaller dyrkes sammen, kan det være muligt at justere størrelsen af hændelsen røntgenstråle, således at kun dele af de enkelte krystaller er eksponeret. I ekstreme tilfælde kan det være nødvendigt at ty til en dataindsamlings strategi svarende til MeshAndCollect-tilgangen35. Sammenfattende, mens der er visse begrænsninger forbundet med stikprøven indehavere, disse kan overvindes i de fleste tilfælde. Selvfølgelig er det altid muligt, at der opstår situationer, hvor intet af dette er muligt. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at ty til andre krystal monteringsmetoder.
Vi har beskrevet en ny type prøveholder for makromolekylær krystallografi, og vi har påvist egnetheden af prøveholdere til forskellige anvendelser. Under hensyntagen til den enkle og reproducerbare håndtering af protein krystaller, samt de unikke egenskaber af prøveholdere, mener vi, at disse prøve indehavere vil vise sig at være en værdifuld tilføjelse til arsenal af prøveholdere til makromolekylær krystallografi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke BESSY II, der drives af Helmholtz-Zentrum Berlin for stråle tid adgang og støtte, og afdelingerne af Prøvemiljø og teknisk design for deres hjælp med design og konstruktion og adgang til 3D-printer faciliteter.
AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 – 2.5 µL volume |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number |
Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |