Se presenta un nuevo portamuestras para cristalografía de rayos X macromolecular junto con un protocolo de manipulación adecuado. El sistema permite el crecimiento de cristales, el remojo de cristales y la recopilación de datos de difracción in situ a temperatura ambiente y criogénica sin necesidad de manipulación o montaje de cristales.
La cristalografía de rayos X macromolecular (MX) es el método más destacado para obtener conocimientos tridimensionales de alta resolución de macromoléculas biológicas. Un requisito previo para el método es que la muestra cristalina altamente ordenada debe ser cultivada a partir de la macromolécula a estudiar, que luego necesita ser preparada para el experimento de difracción. Este procedimiento de preparación normalmente implica la eliminación del cristal de la solución, en la que se cultivaba, el remojo del cristal en solución de ligando o solución crio-protectora y luego inmovilizar el cristal en un soporte adecuado para el experimento. Un problema grave para este procedimiento es que los cristales macromoleculares son a menudo mecánicamente inestables y bastante frágiles. En consecuencia, el manejo de estos cristales frágiles puede convertirse fácilmente en un cuello de botella en un intento de determinación de la estructura. Cualquier fuerza mecánica aplicada a tales cristales delicados puede perturbar el embalaje regular de las moléculas y puede conducir a una pérdida de poder de difracción de los cristales. Aquí, presentamos un nuevo soporte de muestra todo en uno, que ha sido desarrollado con el fin de minimizar los pasos de manejo de los cristales y, por lo tanto, para maximizar la tasa de éxito del experimento de determinación de la estructura. El soporte de muestra admite la configuración de gotas de cristal reemplazando los resbalones de la cubierta del microscopio de uso común. Además, permite la manipulación in situ del cristal, como el remojo de ligandos, la crioprotección y la formación compleja sin ninguna abertura de la cavidad de cristalización y sin manipulación de cristales. Por último, el portamuestras ha sido diseñado para permitir la recopilación de datos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente y criogénica. Mediante el uso de este soporte de muestra, las posibilidades de dañar el cristal en su camino de la cristalización a la recopilación de datos de difracción se reducen considerablemente, ya que ya no se requiere el manejo directo del cristal.
El conocimiento de la estructura tridimensional de las macromoléculas biológicas constituye una piedra angular importante en todas las investigaciones biológicas, bioquímicas y biomédicas básicas. Esto incluso se extiende a ciertos aspectos traslacionales de tales investigaciones, como por ejemplo el descubrimiento de fármacos. Entre todos los métodos para obtener dicha información tridimensional en la cristalografía de rayos X de resolución atómica se encuentra el más potente y el más prominente como lo demuestra el hecho de que el 90% de toda la información estructural disponible es aportada por los rayos X cristalografía1. El principal requisito previo de la cristalografía de rayos X, que es al mismo tiempo su principal limitación, es que los cristales de calidad difracción tienen que ser producidos y preparados para el experimento de difracción. Este paso sigue constituyendo uno de los principales cuellos de botella del método.
Históricamente, los datos de difracción de los cristales proteicos se recogieron a temperatura ambiente. Los cristales individuales se transfirieron cuidadosamente a los capilares de vidrio o cuarzo antes de la recogida dedatos, se añadió licor de madre a los capilares para que los cristales no se secaran y los capilares se sellaran 2,3, 4. Desde la década de 1980, se hizo cada vez más evidente que debido a las propiedades ionizantes de la radiación X y la inminente sensibilidad a la radiación de los cristales macromoleculares, la recolección de datos a temperatura ambiente plantea severas limitaciones en el método. En consecuencia, se desarrollaron enfoques para mitigar los efectos de los daños por radiación mediante el enfriamiento de cristales macromoleculares de hasta 100 K y para recopilar datos de difracción a tan baja temperatura5,6. Para trabajar a bajas temperaturas, el montaje de las muestras en capilares se volvió poco práctico debido a la baja tasa de transferencia de calor. A pesar de esto, hay esfuerzos en curso para utilizar también capilares, en particular de experimentos de cristalización de contradifusión, para trabajos de difracción a baja temperatura7,8, pero, independientemente de eso, se convirtió en el estándar enfoque en la cristalografía macromolecular para montar cristales macromoleculares sostenidos por una película delgada de licor madre dentro de un bucle delgado con cable9,10. A pesar de que una serie de mejoras (por ejemplo, la introducción de bucles litográficos y estructuras similares11)se han hecho a lo largo del tiempo a este montaje basado en bucle, los principios básicos que se desarrollaron a principios de la década de 1990 todavía están en uso hoy en día. Se puede afirmar con seguridad que la mayoría de las colecciones de datos de difracción en cristales macromoleculares hoy en día todavía se basan en este enfoque5.
Con el tiempo, hubo algunos nuevos desarrollos y modificaciones interesantes del método de montaje basado en bucles, pero estos enfoques hasta ahora no han sido ampliamente adoptados en la comunidad. Uno es el llamado montaje sin bucle de cristales, que fue desarrollado para lograr una dispersión de fondo más baja12,13,14. Otro es el uso de vainas de grafeno para envolver las muestras cristalinas y protegerlas del secado. El grafeno es un material adecuado en ese sentido debido a su muy bajo fondo de dispersión de rayos X15.
Más recientemente, los desarrollos en el campo de los soportes de muestra se centraron principalmente en la estandarización de los soportes con el objetivo de aumentar el rendimiento de la muestra16 o en el diseño de soportes, que pueden contener más de una muestra17,como por ejemplo membranas estampadas sobre un marco de silicio, que son capaces de contener cientos de pequeños cristales principalmente en el campo de la cristalografía en serie18,19,20,21,22.
Todos los métodos de montaje de muestras discutidos hasta ahora todavía requieren cierto grado de intervención manual, lo que significa que existe un peligro inherente de causar daños mecánicos a la muestra. Por lo tanto, se están buscando enfoques novedosos mediante la ingeniería del entorno de la muestra, de tal forma que los datos de difracción de los cristales puedan ser recogidos dentro de su entorno de crecimiento. Uno de estos métodos se denomina in situ o de detección de placas23,24 y ya se ha implementado en una serie de líneas de haz de cristalografía macromolecular en diversas fuentes de sincrotrón en todo el mundo25. Sin embargo, el uso de este método está limitado por los parámetros geométricos de la placa de cristal y el espacio disponible alrededor del punto de muestra del instrumento.
Sin embargo, otro enfoque se realiza en el llamado sistema CrystalDirect26. Aquí, las gotas de cristalización enteras se cosechan automáticamente. Las láminas sobre las que se han cultivado los cristales se cortan a medida con un láser y se utilizan directamente como portamuestras27.
En el trabajo descrito aquí, el objetivo era desarrollar un portamuestras, que permitiera al usuario mover la muestra cristalina de su cámara de crecimiento al dispositivo de recopilación de datos sin tocarlo y que permitiera al usuario manipular la muestra fácilmente. Dado que muchos investigadores en el campo de la cristalografía macromolecular todavía están utilizando el formato de cristalización de 24 pozos para optimizar el crecimiento de cristales mediante la modificación de las condiciones identificadas en grandes campañas de cribado, el nuevo portamuestras fue diseñado para ser compatible con este formato. A continuación, se describirá el diseño del nuevo portamuestras y se demostrará el manejo y el rendimiento del portamuestras para la recopilación de datos in situ y el remojo de ligandos. Por último, se discutirá la idoneidad de este nuevo portamuestras, así como sus limitaciones para las diversas etapas de trabajo.
Adecuación para experimentos de cristalización. Los nuevos portamuestras se pueden utilizar para experimentos de cristalización de gotas colgantes estándar utilizando placas de tipo Linbro de 24 pocillos (tipos 1 y 2), o placas de huella SBS de 24 pocillos en las que cada pocal tiene un diámetro de 18 mm (tipo 3). Se pueden utilizar en lugar de los resbalones de la cubierta del microscopio estándar. La lámina CÓrceca amorfa garantiza la estanqueidad del sistema. El monitoreo del experimento de cristalización es posible utilizando un microscopio de luz de transmisión, debido al uso de láminas de alta claridad. Hasta nuestro conocimiento, no existen otros portamuestras para placas de cristalización de 24 pocillos, lo que permitiría experimentos de manipulación o difracción de cristal, sin quitar mecánicamente el cristal de la gota, en el que se cultiva. Esto es de particular importancia, ya que muchos investigadores en el campo todavía confían en tales placas para la optimización de cristal, debido al hecho de que los volúmenes de gota más grandes se pueden utilizar en comparación con las placas de caída de 96 pocillos. Con estos volúmenes de caída más grandes, se pueden obtener cristales más grandes.
Adecuación para manipulación decristales. Debido a las propiedades de autorreparación de la lámina exterior de COC y la estructura microporosa de la lámina de poliimida amarilla interna, el entorno cristalino es accesible y los cristales se pueden manipular sin transferirlos mecánicamente a otros recipientes. Esto hace que los portamuestras sean muy convenientes. El único otro sistema que conocemos, que permite este acceso indirecto y suave al cristal, es el sistema CrystalDirect26. Sin embargo, CrystalDirect es menos flexible ya que se deben utilizar placas especiales de cristalización de 96 pocillos. La lámina, en la que los cristales están creciendo, es la misma que sella el experimento de cristalización y no es auto-curación. Esto significa que una abertura que ha sido perforada en la lámina por ablación láser para la entrega de ligando o crio-protector a los cristales permanecerá abierta, aumentando la posibilidad de evaporación líquida. Esto contrasta con nuestro diseño, donde los cristales no se expondrán directamente al medio ambiente, incluso si la lámina COC se perfora varias veces.
Adecuación para experimentos de difracción in situ a temperatura ambiente. El soporte de muestra se puede retirar de la placa de cristalización de una manera directa, pegado a una base magnética y poner en un goniómetro de línea de haz. Para un experimento de difracción a temperatura ambiente, es aconsejable poner la muestra en una corriente de aire de humedad definida33. El licor madre alrededor del cristal se puede retirar antes de poner el soporte de la muestra en el goniómetro con el fin de reducir la dispersión del fondo. Tal configuración es estable durante horas.
Adecuación del material utilizado para operación y almacenamiento a 100K. Ni el material utilizado para la producción del portamuestras ni la película de poliimida se ven afectados negativamente por enfriarlos a bajas temperaturas34. Por lo tanto, trabajar con el portamuestras a baja temperatura (por ejemplo, 100 K) no plantea un problema grave.
Adecuación para experimentos de difracción in situ a 100K. Para la recolección de datos a 100 K en una corriente de nitrógeno, el soporte de la muestra debe retirarse de la placa de cristalización como en el párrafo anterior, pegarse a una base magnética y colocarse en una corriente de nitrógeno gaseoso a 100 K en un goniómetro de línea de haz. Si se desea, la muestra también puede estar protegida contra crio, aunque es probable que para muestras desnudas esto no sea necesario en la mayoría de los casos31. Para experimentos a 100 K, los portamuestras tipo 2 y 3 son más adecuados porque el anillo de plástico exterior se puede quitar. Por lo tanto, son de menor tamaño y por lo tanto deben ser menos propensos a la guinda. Sin embargo, incluso se puede utilizar un portamuestras de tipo 1. Dada una humedad no demasiado alta en la cabaña experimental y una guinda del sistema crio-correcto del soporte no es realmente un problema.
Limitaciones. La geometría del portamuestras permite la recopilación de datos de difracción sin obstáculos mediante el método de rotación en un rango de rotación total de 160o. Esto es suficiente para que se puedan obtener conjuntos de datos de difracción completos para la mayoría de los sistemas de cristal. En los casos en que esto no sea posible, los datos de más de cristal deben fusionarse. Cuando los cristales se cultivan juntos, puede ser posible ajustar el tamaño del haz de rayos X incidente para que solo se expongan partes de cristales individuales. En casos extremos, es posible que sea necesario recurrir a una estrategia de recopilación de datos similar al enfoque35de MeshAndCollect. En resumen, si bien hay ciertas limitaciones asociadas con los tomadores de muestras, estas pueden superarse en la mayoría de los casos. Por supuesto, siempre es posible que se encuentren situaciones, en las que nada de esto es posible. En tales casos, uno puede necesitar recurrir a otros métodos de montaje de cristal.
Hemos descrito un novedoso tipo de portamuestras para la cristalografía macromolecular y hemos demostrado la idoneidad de los portamuestras para diversas aplicaciones. Teniendo en cuenta el manejo sencillo y reproducible de los cristales proteicos, así como las propiedades únicas de los portamuestras, creemos que estos portamuestras resultarán ser una adición valiosa al arsenal de portamuestras para los portamuestras Cristalografía.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a BESSY II, operado por Helmholtz-Zentrum Berlin por el acceso y soporte de tiempo de haz, y a los departamentos de Sample Environment and Technical Design por su ayuda con el diseño y la construcción y el acceso a las instalaciones de impresoras 3D.
AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 – 2.5 µL volume |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 – 20 µL), manufacturer reference number |
Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |