小鼠乳腺肿瘤细胞在体外入侵测定中作为致癌细胞行为的测量
Summary
体外细胞入侵测定使用含有蛋白质基质的细胞培养插入物,通过量化细胞入侵和迁移的可能性来测量癌症转移的潜能。细胞面临的挑战是通过蛋白质基质和多孔膜迁移,向化学吸引剂迁移,然后通过光显微镜进行量化。
Abstract
体外入侵测定使用博伊登室中富含蛋白质的基质来测量培养细胞通过基质和多孔膜的能力,其过程类似于癌细胞转移的初始步骤。被测试的细胞可以改变基因表达,或用抑制剂处理,以测试入侵潜力的变化。该实验测试小鼠乳腺肿瘤细胞的侵略性表型,以发现和表征促进细胞入侵的潜在肿瘤基因。然而,这种技术是通用的,可以适用于许多不同的应用。实验本身可以在一天内完成,结果在不到一天内通过光显微镜获得。结果包括用于比较和分析的入侵细胞数计数。体外入侵测定是一种快速、廉价和清晰的方法,用于确定培养物中的细胞行为,在更多地参与体内检测之前可用作初始评估。
Introduction
体外入侵测定在测量细胞通过蛋白质涂层膜迁移的能力时可能是一个有用的工具,类似于转移的第一步。恶性癌细胞的一个关键特征是它们能够通过附近的组织迁移和入侵。已经扩散或转移的癌症带来了更多的治疗挑战,并且长期存活率较低,而局部肿瘤更容易治疗,并且具有更高的长期存活率。为了转移,癌细胞必须离开原发性肿瘤,并迁移到循环或淋巴系统,这个过程需要通过细胞外基质和基底膜1。在称为上皮间质过渡(EMT)的过程中,肿瘤细胞必须打破细胞-细胞接触,定向迁移,并侵入附近的血液或淋巴血管。这个转移级联的初始步骤是极大的兴趣,因为这些步骤是什么可以使癌症更致命。转移早期步骤所涉及的遗传和表观遗传因素是大量研究的重点,但需要准确可靠的实验工具来测试这些早期步骤,包括体内和体外步骤。
测量细胞迁移变化的工具,如伤口愈合(划痕)测定或3D环境中的生长,如软琼脂测定,可以部分满足测量转移早期步骤的实验方法的需要,但测量入侵的测定是更具挑战性,因为这个过程发生在复杂的肿瘤微环境中的体内。为了筛选药物或基因改变,以确定入侵和转移中的重要因素,一个系统,可以在体外使用培养细胞和模拟转移细胞在体内面临的挑战是入侵测定2, 3.乳腺癌是女性最常诊断的癌症类型,也是女性癌症死亡的第二大原因,因此了解导致乳腺癌细胞入侵和转移的基因对公众健康至关重要。此外,小鼠细胞是研究乳腺癌及其进展的有用模型系统。
体外入侵测定基于博伊登室组件,其中两个生长培养层由多孔膜3分离。为了模仿肿瘤微环境,还包括一种富含蛋白质的凝胶,用于将一个腔室中的细胞与另一个腔室中的化学抑制剂分离,并作为基底膜屏障。为了向化学吸引剂迁移,细胞必须首先通过富含蛋白质的屏障,然后穿过多孔膜-这个过程类似于转移细胞如何通过频闪迁移的过程。富含蛋白质的凝胶可以根据实验的需要而改变,但通常由胶原蛋白或基底膜提取物(例如,Matrigel)4组成。它是蛋白质、蛋白酶和生长因子的复杂混合物,但主要由拉明宁和胶原蛋白IV 4,5组成。然后,细胞必须通过通常由聚碳酸酯、聚酯或聚四氟乙烯 (PTFE) 制成的多孔膜。膜可以商业购买,有或没有蛋白质凝胶(通常是胶原蛋白),或者凝胶可以单独购买和添加。孔径可以根据像元大小进行调整。虽然孔径为 0.4 – 8.0 μm,但只有 3.0 – 8.0 μm 的孔隙足够大,适合细胞迁移。入侵测定已用于确定抑制剂对细胞迁移和入侵能力的有效性。虽然缺乏体内存在的确切的肿瘤微环境,体外入侵检测有利于在短时间内筛选许多条件,同时最大限度地减少对动物模型的需求。这些实验的目的是比较疑似肿瘤的基因表达,并使用体外入侵测定和其他测试确定对癌细胞行为和疾病攻击性的影响。总体而言,入侵测定为确定转移电位提供了一致、定量和快速的结果,同时也是一种相对便宜、简单和适应性强的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
体外入侵测定是研究促进癌细胞入侵的因素的一种廉价、快速、定量和直接的方法。乳腺癌是妇女中最常见的癌症。在乳腺癌的三个主要亚型中,三阴性,(或ER,PR-,HER2/neu-),是最具有攻击性的,最有可能转移,也是最致命的9。因此,了解导致转移的基因和表达有助于找到新的治疗靶点和遗传标记。虽然许多对癌细胞入侵和转移重要的基因已经确定和特征,转移驱动因素与转移抑制?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院的R15CA169978资助。额外的资金来自维拉诺瓦大学。
Materials
| 24-well plates | Corning | 353504 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BALB/c mice | |||
| Cell Culture Incubator | |||
| Cell Culture Treated Flasks | |||
| Clinical cenrifuge | |||
| Cotton swab | Puritan | 25-806 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Distilled water | |||
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | high glucose, GlutaMAX |
| Ethanol | |||
| FBS | Sigma Aldrich | F2442-500ML | |
| Forcepts | |||
| Glass Slide | VWR | 16004-422 | |
| HBSS | ThermoFisher | 14025076 | no calcium, no magnesium |
| Hemocytometer | |||
| Imersion oil | |||
| Invasion Chambers (24-well) | Corning | 354480 | Cat. #354481 for 6-well |
| Light Microscope | |||
| Lipofectamine Transfection Reagent | |||
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | |||
| Scalpel, disposable | #11 | ||
| shRNA | |||
| Sterile Transfer pipet | |||
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
Riferimenti
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