Quantification de trois lésions de l’ADN par spectrométrie de masse et évaluation de leurs niveaux dans les tissus de souris exposés à des particules fines ambiantes

Summary

Nous décrivons ici les méthodes de quantification sensible et précise des lésions 8-oxo-7,8-dihydro-2 ‘-désoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n⁶-étheno-2 ‘-désoxyadénosine (1,n⁶-Dado) et 1,n²– étheno-2 ‘-désoxyguanosine (1,N-2dguo) dans l’ADN. Les méthodes ont été appliquées à l’évaluation des effets des particules fines ambiantes (PM_2,5) dans les tissus (poumons, foie et rein) des souris A/J exposées.

Abstract

Les adduits d’ADN et les bases d’ADN oxydées sont des exemples de lésions de l’ADN qui sont des biomarqueurs utiles pour l’évaluation de la toxicité des substances qui sont électrophiliques, génèrent des électrophiles réactifs lors de la biotransformation, ou induisent un stress oxydatif. Parmi les nucléobases oxydées, la plus étudiée est la 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) ou la 8-oxo-7,8-dihydro-2 ‘-désoxyguanosine (8-oxodGuo), un biomarqueur des lésions de base induites oxydativement dans l’ADN. Les aldéhydes et les époxyaldéhydes résultant du processus de peroxydation lipidique sont des molécules électrophiles capables de former des adduits d’ADN exocyclique mutagènes, tels que les adduits d’étheno 1,n²-étheno-2′-désoxyguanosine (1,n²– εdGuo) et 1,n⁶-étheno-2 ‘-désoxyadénosine (1,n⁶-εdado), qui ont été suggérés comme biomarqueurs potentiels dans la pathophysiologie de l’inflammation. Des méthodes sélectives et sensibles pour leur quantification dans l’ADN sont nécessaires à l’élaboration de stratégies préventives pour ralentir les taux de mutation cellulaire et le développement des maladies chroniques (p. ex. cancer, maladies neurodégénératives). Parmi les méthodes sensibles disponibles pour leur détection (chromatographie liquide à haute performance couplée à des détecteurs de spectrométrie de masse électrochimique ou tandem, essai de comète, immunodosages, ³²P-post-étiquetage), les plus sélectifs sont ceux basés sur chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-ESI-MS/MS). La sélectivité est un avantage essentiel lors de l’analyse d’échantillons biologiques complexes et de HPLC-ESI-MS/MS évolué comme étalon-or pour la quantification des nucléosides modifiés dans les matrices biologiques, comme l’ADN, l’urine, le plasma et la salive. L’utilisation de normes internes étiquetées isotopiquement ajoute l’avantage de corrections pour les pertes de molécules au cours de l’hydrolyse de l’ADN et des étapes d’enrichissement de l’analyte, ainsi que pour les différences de l’ionisation de l’analyte entre les échantillons. Il aide également à identifier le pic chromatographique correct lorsque plus d’un pic est présent.

Nous présentons ici des méthodes de HPLC-ESI-MS/MS validées, précises et précises, qui ont été appliquées avec succès pour la quantification du 8-oxodGuo, 1,n⁶-Dado et 1,n²-dguo dans le poumon, le foie et l’ADN des reins des souris A/J pour l’évaluation des effets de l’exposition aux PM_2,5 ambiantes.

Introduction

Certaines espèces d’oxygène réactif (ROS) sont capables d’oxyder des liaisons doubles de carbone de bases d’ADN et de certains carbones dans la portion désoxyribose, générant des bases oxydées et des ruptures de brin d’ADN¹. En tant que molécule chargée négativement riche en atomes d’azote et d’oxygène, l’ADN est aussi une cible pour les groupes électrophiles qui réagissent de façon covalente avec les sites nucléophiles (azote et oxygène), donnant des produits qui sont appelés adduits d’ADN². Ainsi, les adduits d’ADN et les bases d’ADN oxydées sont des exemples de lésions de l’ADN qui sont des biomarqueurs utiles pour l’évaluation de la toxicité des substances qui sont électrophiliques, génèrent des électrophiles réactifs lors de la biotransformation, ou induisent un stress oxydatif^{1, 2}. les deux. Bien que les bases modifiées de l’ADN puissent être retirées de l’ADN par réparation d’excision de base ou de nucléotide (BER ou NER), l’induction d’un déséquilibre entre la génération et l’élimination des lésions de l’ADN en faveur de l’ancien conduit à une augmentation nette de leurs niveaux dans les heures supplémentaires de l’ADN^{3 . Les résultats sont l’augmentation des taux de mutation de l’ADN, l’expression génique réduite et l’activité protéique diminuée2,4,5,6,7, effets qui sont étroitement liés à la développement des maladies. Les mutations de l’ADN peuvent affecter diverses fonctions cellulaires, telles que la signalisation cellulaire, le cycle cellulaire, l’intégrité du génome, la stabilité du télomère, l’épigénome, la structure de la chromatine, l’épissage d’ARN, l’homéostasie protéique, le métabolisme, l’apoptose et la différenciation cellulaire8 ,9. Les stratégies visant à ralentir les taux de mutation cellulaire et le développement des maladies chroniques (p. ex. cancer, maladies neurodégénératives) traversent la connaissance des sources de mutation, parmi lesquelles les lésions de l’ADN et leurs causes.}

Les ROS générés de façon endogène en excès, en raison de l’exposition aux polluants, de l’inflammation persistante, de la pathophysiologie des maladies (p. ex. le diabète), etc., sont des causes importantes de dommages causés par la biomolécule, y compris l’ADN et les lésions lipidiques¹. À titre d’exemple, le radical hydroxyle hautement réactif (OH) formé à partir de H₂O₂ réduction par des ions métalliques de transition (Fe^{2 +}, Cu⁺) oxyde les bases de l’ADN, la portion de sucre d’ADN et les acides gras polyinsaturés à la diffusion contrôlée taux de change¹⁰. Parmi les 80 déjà caractérisés nucléobases oxydées³, la plus étudiée est la 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) ou 8-oxo-7, 8-dihydro-2 ‘-désoxyguanosine (8-oxodGuo, figure 1), une lésion qui est capable d’induire gt transversions dans cellules de mammifères^10,11. Il est formé par l’oxydation mono-électronique de la guanine, ou par le radical hydroxyle ou l’attaque de l’oxygène sinéne de la guanine dans l’ADN¹. Les acides gras polyinsaturés sont d’autres cibles importantes d’oxydants hautement réactifs, tels que ^•Oh, qui initie le processus de peroxydation lipidique^1,12. Il donne lieu à des hydroperoxydes d’acides gras qui peuvent se décomposer en aldéhydes électrophiliques et en époxyaldéhydes, comme le malondialdéhyde, le 4-hydroxy-2-nonenal, le 2,4-décadienal, le 4,5-époxy-(2E)-décénal, l’Hexénal, l’acroléine, le crotonaldéhyde, qui sont capables de former des adduits d’ADN exocyclique mutagènes, tels que les adduits de malondialdéhyde-, Propano-ou étheno^1,12,13. Les adduits d’étheno 1,n²-étheno-2′-désoxyguanosine (1,n²-εdguo, figure 1) et 1,n⁶-étheno-2 ‘-désoxyadénosine (1,n⁶-εdado, figure 1 ) ont été suggérés comme biomarqueurs potentiels dans la pathophysiologie de l’inflammation^14,15.

La figure 1. Les structures chimiques des lésions de l’ADN quantifiées dans la présente étude. dR = 2 ́-désoxyribose. Ce chiffre a été modifié à partir de Oliveira et al.³⁴. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Des études réalisées au début des années 1980 ont permis la détection sensible du 8-oxodGuo par chromatographie liquide à haute performance couplée à la détection électrochimique (HPLC-ECD). La quantification du 8-oxodguo par HPLC-ECD dans plusieurs systèmes biologiques soumis à des conditions oxydantes a conduit à la reconnaissance du 8-oxodguo comme biomarqueur des lésions de base induites oxydativement dans l’ADN^1,16. Bien que robustes et permettant la quantification du 8-oxodGuo dans la gamme faible de fmol¹⁷, les mesures HPLC-ECD reposent sur la précision du temps de rétention de l’analyte pour l’identification de l’analyte et sur la résolution de la chromatographie afin d’éviter les interférences de autres constituants de l’échantillon. Comme la détection électrochimique nécessite l’utilisation de sel (p. ex., phosphate de potassium, acétate de sodium) dans la phase mobile, le maintien de conditions analytiques adéquates nécessite un temps de nettoyage de la colonne et du matériel de routine.

Alternativement, l’utilisation de l’enzyme de réparation de l’ADN bactérien formamidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) et, par la suite, de l’humain 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), pour la détection et l’enlèvement de 8-oxoGua de l’ADN, est apparu comme un moyen pour l’induction de l’ADN labiles Sites. Les sites labiles alcalins sont convertis en ruptures de brin d’ADN et permettent la quantification indirecte très élevée sensible de la 8-oxoGua par électrophorèse alcaline de gel de cellule simple («dosage de comète»). La haute sensibilité et l’accomplissement des analyses sans besoin d’extraction d’ADN cellulaire sont les principaux avantages de ce type de dosage. Il donne les plus faibles niveaux stables de 8-oxoGua dans l’ADN, typiquement 7-10 fois plus bas que les niveaux obtenus par des méthodes bioanalytiques basées sur HPLC. Cependant, il s’agit d’une mesure indirecte de la 8-oxogua et certains inconvénients sont le manque de spécificité ou l’efficacité inconnue des enzymes de réparation utilisés^1,16,18.

Les immunodosages sont d’autres méthodes utilisées pour la détection des adduits de l’ADN 8-oxoGua¹ et exocyclique, tels que 1,n⁶-Dado et 1,n²-dguo¹². Malgré la sensibilité, une lacune de l’utilisation des anticorps pour la détection des lésions de l’ADN est le manque de spécificité en raison de la réactivité croisée à d’autres composants d’échantillons biologiques, y compris les bases normales d’ADN^1,12. Les adduits d’ADN exocycliques, y compris 1,n⁶-Dado et 1,n²-dguo, peuvent également être détectés et quantifiés par des essais de P-post-étiquetage ³²hautement sensibles¹². La sensibilité élevée de ³²P-le post-étiquetage permet l’utilisation de très petites quantités d’ADN (par exemple, 10 μg) pour la détection d’environ 1 adduit par 10¹⁰ bases normales¹⁹. Cependant, l’utilisation de la radio-chimie, le manque de spécificité chimique et la faible précision sont quelques inconvénients^19,20.

Une limitation partagée des méthodes citées ci-dessus est la faible sélectivité ou spécificité pour la détection des molécules souhaitées. Dans ce scénario, la HPLC couplée à la spectrométrie de masse en tandem par ionisation par ÉLECTROPULVÉRISATION (HPLC-ESI-MS/MS et HPLC-MS³) a évolué comme étalon-or pour la quantification des nucléosides modifiés dans les matrices biologiques, comme l’ADN, l’urine, le plasma et la salive le ^{premier ,} le ^{19 , 20}. les avantages des méthodes HPLC-ESI-MS/MS sont la sensibilité (typiquement dans la plage de fmol faible) et la haute spécificité fournie par i) la séparation chromatographique, II) le schéma caractéristique et connu de la fragmentation des molécules à l’intérieur de la masse chambre de collision du spectromètre, et III) la mesure exacte du rapport masse/charge sélectionné (m/z) en mode de surveillance de réaction multiple^1,19. L’utilisation de normes internes étiquetées isotopiquement ajoute l’avantage de corrections pour les pertes de molécules au cours de l’hydrolyse de l’ADN et des étapes d’enrichissement de l’analyte, ainsi que pour les différences de l’ionisation de l’analyte entre les échantillons. Il aide également à identifier le pic chromatographique correct lorsque plus d’un pic est présent^1,12,19,20.

Plusieurs méthodes basées sur HPLC-ESI-MS/MS ont été utilisées pour la quantification de 8-oxodguo, 1, n⁶-Dado et 1,n²-dguo dans l’ADN extrait de différents échantillons biologiques^{12,15,20 ,21},²²,^{23,24,25,26,27},^28,29 . Particules fines (PM_2,5) portent des produits chimiques organiques et inorganiques, tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), les nitro-HAP, les aldéhydes, les cétones, les acides carboxyliques, les quinolines, les métaux et les ions solubles dans l’eau, qui peuvent induire une inflammation et stress oxydatif, conditions qui favorisent l’apparition de dommages de biomolécule et de la maladie^30,31,32,33. Nous présentons ici les méthodes validées HPLC-ESI-MS/MS qui ont été appliquées avec succès pour la quantification de 8-oxodGuo, 1,n⁶-Dado et 1,n²-dguo dans l’ADN pulmonaire, hépatique et rénale de souris A/J pour l’évaluation de la effets de l’exposition ambiante_2,5 de PM³⁴.

Protocol

Des souris A/J mâles de quatre semaines, exemptes de pathogènes spécifiques, ont été obtenues du centre d’élevage des animaux de laboratoire de Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brésil, et ont été traitées en conséquence au Comité d’éthique de la faculté de médecine, Université de São Paulo (protocole no 1310/09). 1. ramassage des tissus de souris Anesthésier l’animal avec la xylazine et la kétamine. Pour une souris de 30 g de poid…

Representative Results

Les concentrations moyennes d’ADN (± SD) obtenues à partir du foie de souris (~ 1 g de tissu), du poumon (~ 0,2 g de tissu) et du rein (~ 0,4 g de tissu) ont été respectivement 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021 et 3 223 ± 723 μg/mL dans le volume final de 200 μL. Un chromatogramme représentatif obtenu par HPLC-DAD de l’ADN purifié est illustré à la figure 3. La présence des quatre 2 ‘-désoxynucléosides, exempts des ribonucléosides d’ARN, qui…

Discussion

Un problème majeur trouvé dans les analyses de 8-oxodguo par HPLC méthodes est l’induction possible de sa formation au cours des procédures de travail de l’extraction de l’ADN, l’hydrolyse de l’ADN, et la concentration des hydrolysats d’ADN^22,38. Afin de minimiser le problème de la formation artifactuelle 8-oxodGuo, il est recommandé l’addition de la déféroxamine à toutes les solutions d’extraction, de stockage et d’hydrolyse de l’ADN…

Materials

[15N5]-2’-deoxyadenosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3899-CA-10
acetonitrile	Carlo Erba Reagents	412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa	Sigma	P5521
ammonium acetate	Merck	101116
calf thymus DNA	Sigma	D1501
cell lysis solution	QIAGEN	158908
chloroform	Carlo Erba Reagents	412653
deferoxamine	Sigma	D9533
deoxyribonuclease I (DNase I)	Bio Basic Inc	DD0649
ethanol	Carlo Erba Reagents	414542
formic acid	Sigma-Aldrich	F0507
HPLC-ESI-MS/MS system	HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments	HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system	Shimadzu	Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18)	Phenomenex	00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18)	Phenomenex	00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18)	Phenomenex	00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)	Phenomenex	AJO-4287
isoamyl alcohol	Sigma-Aldrich	M32658
isopropyl alcohol (isopropanol)	Carlo Erba Reagents	A412790010
ketamine	Ceva	Commercial name: Dopalen
magnesium chloride	Carlo Erba Reagents	349377
magnesium chloride	Sigma	M2393
methanol	Carlo Erba Reagents	L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox	Sigma	P4506
protein precipitation solution	QIAGEN	158912
proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
ribonuclease A	Sigma	R5000
sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
SPE-C18 (Strata-X)	Phenomenex	8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Carlo Erba Reagents	489983
xylazine	Syntec do Brasil	Commercial name: Xilazin