Quantifizierung von drei DNA-Mäsionen durch Massenspektrometrie und Bewertung ihrer Niveaus in den Themen von Mäusen, die der zämatten Feinstaub ausgesetzt sind

Summary

Wir beschreiben hier Methoden zur sensiblen und genauen Quantifizierung der Läsionen 8-oxo-7,8-Dihydro-2 ‘-deoxyguanosine (8-oxodGuo),1, N⁶-etheno-2 ‘-deoxyadenosine (1,N⁶-dAdo) und 1,N²– Etheno-2 ‘-deoxyguanosine (1,N₂-dGuo) in der DNA. Die Methoden wurden zur Beurteilung der Auswirkungen von Umgebungsfeinstaub (PM 2,5) inGeweben (Lunge, Leber und Niere) von exponierten A/J-Mäusen eingesetzt.

Abstract

DNA-Addukte und oxidierte DNA-Basen sind Beispiele für DNA-Läsionen, die nützliche Biomarker für die Toxizitätsbewertung von Substanzen sind, die elektrophil sind, reaktive Elektrophilen nach Bioveränderung erzeugen oder oxidativen Stress verursachen. Unter den oxidierten Nukleobasen ist die am meisten untersuchte 8-oxo-7,8-Dihydroguanin (8-oxoGua) oder 8-oxo-7,8-Dihydro-2 ‘-Deoxyguanosin (8-oxodGuo), ein Biomarker von oxidativ induzierten Basisschäden in der DNA. Aldehyde und Epoxyaldehyde, die aus dem Lipidperoxidationsprozess resultieren, sind elektrophile Moleküle, die in der Lage sind, mutagene exozyklische DNA-Adduktezu bilden, wie zum Beispiel die Etheno-Addukte 1, N 2-etheno-2 ‘-deoxyguanosine (1,N²– Die “Guo” und “1, N⁶-etheno-2″-deoxyadenosine (1,N⁶-bobdAdo), die als potenzielle Biomarker in der Pathophysiologie der Entzündung vorgeschlagen wurden. Für die Entwicklung präventiver Strategien zur Verlangsamung von Zellmutationsraten und chronischer Krankheitsentwicklung (z.B. Krebs, neurodegenerative Erkrankungen) sind selektive und sensible Methoden für ihre Quantifizierung in der DNA notwendig. Unter den für ihre Erkennung zur Verfügung stehenden sensiblen Methoden (Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit elektrochemischen oder Tandemmassenspektrometrie-Detektoren, Kometenuntersuchungen, Immunoassays, 32 P-Postbeschriftung) sind die selektivsten, ^{die auf}der Grundlage von Auf Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS). Die Selektivität ist ein wesentlicher Vorteil bei der Analyse komplexer biologischer Proben, und HPLC-ESI-MS/MS entwickelte sich als Goldstandard für die Quantifizierung von veränderten Nukleoside in biologischen Matrizen wie DNA, Urin, Plasma und Speichel. Der Einsatz isotopisch beschrifteter interner Standards erhöht den Vorteil von Korrekturen für Molekülverluste während der DNA-Hydrolyse-und Analytenanreicherungsschritte sowie für Unterschiede bei der Analytitisierung zwischen Proben. Es hilft auch bei der Identifizierung des korrekten chromatographischen Peaks, wenn mehr als ein Peak vorhanden ist.

Wir stellen hier validierte sensible, genaue und präzise HPLC-ESI-MS/MS-Methoden vor, die erfolgreich für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1, N⁶-dAdo und 1,N²-dGuo in Lungen-, Leber-und NierenDNA von A/J-Mäusen eingesetzt wurden. Die Bewertung der Auswirkungen der Umgebungsbelastung PM 2.5.

Introduction

Einige reaktive Sauerstoffarten (ROS) sind in der Lage, Kohlenstoff-Doppelbindungen von DNA-Basen zu oxidieren und einige Kohlenstoff in der Deoxyribose-Feuchtigkeit, wodurch oxidierte Basen und DNA-Strangbrüche 1 erzeugt werden^. Als negativ geladenes, stickstoff-und Sauerstoffatome geladenes Molekül ist die DNA auch ein Ziel für elektrophile Gruppen, die mit den nukleophilen Standorten (Stickstoff und Sauerstoff) kovalent reagieren und Produkte liefern,die als DNA-Adduktoren bezeichnet werden. DNA-Addukte und oxidierte DNA-Basen sind also Beispiele für DNA-Läsionen, die nützliche Biomarker für die Toxizitätsbewertung von elektrophilen Substanzen sind, reaktive Elektrophilen bei Bioveränderung erzeugen oder oxidativen Stress erzeugen^{1, 2}. Runde Obwohl die modifizierten DNA-Basen durch Basis-oder Nukleotid-Exzisionsreparatur (BER oder NER) aus der DNA entfernt werden können, führt die Induktion eines Ungleichgewichts zwischen der Erzeugung und Entfernung von DNA-Läsionen zu Gunsten der ersteren zu einer Nettoerhöhung ihrer DNA-Überstunden 3^{. Ergebnisse sind die Erhöhung der DNA-Mutationsraten, eine verminderte Genexpression und eineverminderte Proteinaktivität 2, 4,5, 6, 7,Effekte, die engmitder Entwicklung von Krankheiten. DNA-Mutationen können sich auf verschiedene zelluläre Funktionen auswirken, wie z. B. Zellsignalisierung, Zellzyklus, Genomintegrität, Telomerstabilität, Epigenom, Chromatin-Struktur, RNA-Splicing, Protein-Haffeestose, Stoffwechsel, Apoptose und Zelldifferenzierung8 ,9. Strategien zur Verlangsamung von Zellmutationsraten und chronischer Krankheitsentwicklung (z.B. Krebs, neurodegenerative Erkrankungen) durchlaufen das Wissen um die Mutationsquellen, darunter DNA-Läsionen und deren Ursachen.}

ROS, die endogen im Übermaß erzeugt werden, aufgrund von Schadstoffexposition, hartnäckiger Entzündung, Krankheitspophysiologie (z.B. Diabetes), etc., sind wichtige Ursachen für Biomolekule-Schäden, einschließlichDNA und Fettschäden 1. Zum Beispiel oxidiert das hochreaktive Hydroxylradikal (OH), das sich aus der H₂O 2-Reduktion durch Übergangs-Metallionen (Fe^{2 +}, Cu⁺) gebildet hat, die DNA-Basen, die DNA-Zuckergerüchte und die mehrfach ungesättigten Fettsäuren bei diffusionsgesteuerten Fettsäuren. Sätze¹⁰. Unter den 80 bereits charakterisierten oxidierten Nukleobasen³, Die am meisten untersuchte ist 8-oxo-7,8-Dihydroguanin (8-oxoGua) oder 8-oxo-7,8-Dihydro-2 ‘-Deoxyguanosin (8-oxodGuo , Abbildung1), eine Läsion, die in der Lage ist, GT-Transformatoren in induzieren Säugetierzellen^10,11. Es wird durch die monoelektronische Oxidation von Guanin oder durch Hydroxylradikal oder Singlet-Sauerstoff-Attacke von Guanin in DNA^{1 gebildet}. Polyungesättigte Fettsäuren sind weitere wichtige Ziele hochreaktiver Oxidantien, wie ^{zum Beispiel • OH}, die den Prozess der Fettperoxidation^1,12diGang setzen. Es entstehen Fettsäure-Hydroperoxide, die zu elektrophilen Aldehyden und Epoxyaldehyden zersetzen können, Wie Malondialdehyd, 4-hydroxy-2-nonenal, 2,4-deadienal, 4,5 epoxy-(2E)-dezental, hexenal, Akrolein, Krotonaldehyd, die In der Lage, mutagene exozyklische DNA-Addukte wie Malondialdehyde-, Propano-oder Etheno-Addukte 1,12,¹³zu bilden. Das Etheno Addukte 1,N²-etheno-2 ‘-deoxyguanosine (1,N²-DGuo , Abbildung 1) und 1,N⁶-etheno-2 ‘-deoxyadenosine (1,N⁶-madAdo, Abbildung 1 ) wurden als potenzielle Biomarker in der Pathophysiologie der Entzündung14,15^{vorgeschlagen}.

Bild 1. Chemische Strukturen der DNA-Läsionen, die in der vorliegenden Studie quantifiziert wurden. DR = 2 ́-deoxyribose. Diese Figur wurde von Oliveira et al. 34 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Studien, die in den frühen 1980er Jahren durchgeführt wurden, ermöglichten die sensible Erkennung von 8-oxodGuo durch eine hochleistungsfähige Flüssigchromatographie in Verbindung mit elektrochemischer Erkennung (HPLC-ECD). Die Quantifizierung von 8-oxodGuo durch die HPLC-ECD in mehreren biologischen Systemen, die oxidierenden Bedingungen unterworfen waren, führte zur Erkennung von 8-oxodGuo als Biomarker oxidativ induzierter Grundschäden in DNA^1,16. Obwohl robust und die Quantifizierung von 8-oxodGuo im niedrigen Fmol-Bereich 17 ermöglicht, setzen die HPLC-EKD-Messungen auf die Genauigkeit der Analyte-Retendesszeit zur Analyteerkennung und auf die Chromatographie-Auflösung, um Störungen von Andere Stichproben. Da die elektrochemische Erkennung den Einsatz von Salz (z.B. Kaliumphosphat, Natriumacetat) in der mobilen Phase erfordert, benötigt die Aufrechterhaltung adäquater Analysebedingungen eine routinemäßige Säulen-und Gerätereinigungszeit.

Alternativ ist die Verwendung des bakteriellen DNA-Reparaturenzyms formamidopyrimidine DNA Glycosylase (FPG) und, Danach entstand menschliches 8-oxoguanin-Glykosylase 1 (hOGG1) zur Erkennung und Entfernung von 8-oxoGua aus der DNA als Mittel zur Induktion von DNA-Alkali labile Websites. Die Alkali-Labillierungsstellen werden in DNA-Strang-Breaks umgewandelt und ermöglichen die sehr hohe empfindliche indirekte Quantifizierung von 8-oxoGua durch alkalische Einzelzellen-Gel-Elektrophorese (“Kometenuntersuchen”). Die hohe Empfindlichkeit und die Durchführung der Analysen ohne zelluläre DNA-Extraktion sind die Hauptvorteile dieser Art von Test. Es gibt den niedrigsten Stand-Zustand-Wert von 8-oxoGua in der DNA, in der Regel 7-10 Mal niedriger als die, die durch bioanalytische Methoden auf der Basis von HPLC erhalten. Es handelt sich jedoch um eine indirekte Messung von 8-oxoGua und einige Nachteile sind die fehlende Spezifität oder die unbekannte Effizienz der verwendeten Reparaturenzyme^1,16,^18.

Immunoassays sind weitere Methoden, die zur Erkennung von 8-oxoGua¹ und exozyklischen DNA-Addukten verwendet werden, wie1, N⁶-dAdo und 1,N²-dGuo¹². Trotz der Empfindlichkeit ist ein Mangel an Antikörpern zur Erkennung von DNA-Läsionen der Mangel an Spezifität aufgrund von Kreuzreaktionen auf andere Bestandteile biologischer Proben, einschließlich der normalenDNA-Basen 1^,12. Die exozyklischen DNA-Addukte, darunter 1,N⁶-dAdo und1, N²-dGuo, können auch durch hochsensible ³²P-Postbeschriftungsuntersuchungen 12 erkanntund quantifiziert werden. Die hohe Empfindlichkeit von ³²P-Postbeschriftung ermöglicht die Verwendung von sehr geringen Mengen an DNA⁽z.B. 10 μg) zur Erkennung von etwa 1 Addukt pro 10^{10 normalen} Basen 19. Allerdings sind der Einsatz von Radio-Chemikalien, mangelnde chemische Spezifität und geringe Genauigkeit einige Nachteile 19,^20.

Eine gemeinsame Einschränkung der oben genannten Methoden ist die geringe Selektivität oder Spezifität für die Erkennung der gewünschten Moleküle. In diesem Szenario entwickelte sich HPLC in Verbindung mit der Elektrospray-Ionisierung der Massenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS und HPLC-MS³) zu dem Goldstandard für die Quantifizierung von modifizierten Nukleoside in biologischen Matrizen, wie DNA, Urin, Plasma und Speichel. ^{1 , 19 , 20}. Vorteile der HPLC-ESI-MS/MS-Methoden sind die Empfindlichkeit (typischerweise im niedrigen Fmol-Bereich) und die hohe Spezifität, die i zur Verfügung stellt, die chromatographische Trennung, ii) das charakteristische und bekannte Muster der Molekül-Fragmentierung innerhalb der Masse Spektrometer-Kollisionskammer, und iii) die genaue Messung des ausgewählten Massen-bis Ladungsverhältnisses (m/z) im Multitreaktionsüberwachungsmodus 1,19^. Der Einsatz isotopisch beschrifteter interner Standards erhöht den Vorteil von Korrekturen für Molekülverluste während der DNA-Hydrolyse-und Analytenanreicherungsschritte sowie für Unterschiede bei der Analytitisierung zwischen Proben. Es hilft auch bei der Identifizierung der richtigen chromatographischen Spitze, wenn mehr als ein Peak ist1,12,19,20.

Für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,¹,N⁶-dAdo und 1,^{N 2}-dGuo in DNA, die aus verschiedenen biologischen Proben gewonnen wurde, wurden mehrere Methoden verwendet, die auf HPLC-ESI-MS/MS^{basieren. ,21,22, 23,24, 25}, 26, 27^,28,29 . Feinstaub (PM 2.5) trägt organische und anorganische Chemikalien, wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), Nitro-PAHs, Aldehyde_,Ketone, Carboxylsäuren, Quinoline, Metalle und wasserlösliche Ionen, die Entzündungen verursachen können und Oxidativer Stress, Bedingungen, die das Auftreten von Biomolekule-Schäden und Krankheit^30,31,^32,33^begünstigen. Wir stellen hier validierte HPLC-ESI-MS/MS-Methoden vor, die erfolgreich für die Quantifizierung von 8-oxodGuo,1, N⁶-dAdo und 1,N²-dGuo in Lungen-, Leber-und Nieren-DNA von A/J-Mäusen zur Beurteilung der Die Auswirkungen der Umgebungsbelastung^PM2.5 34.

Protocol

Vier Wochen alte männliche A/J-Mäuse, spezifische Erreger frei, wurden vom Zuchtzentrum für Labortiere der Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasilien, erhalten und entsprechend dem Ethikkomitee der Medizinischen Fakultät der Universität behandelt São Paulo (Protokoll no 1310/09). 1. Sammlung von Mäzenen Das Tier mit Xylazine und Ketamin betäuben. Für eine Maus mit 30 g Körpergewicht, injizieren Sie eine Lösung (nicht mehr als 2 mL) mit 2,63 mg …

Representative Results

Die durchschnittlichen DNA-Konzentrationen (± SD), die von der Mäuselleber (~ 1 g Gewebe) gewonnen werden, Die Lunge (~ 0,2 g Gewebe) und die Niere (~ 0,4 g Gewebe) waren jeweils 5,068 ± 2,615, 4.369 ± 1,021 und 3,223 ± 723 μg/mL im Endvolumen von 200 μL. Ein repräsentatives Chromatogramm, das von HPLC-DAD der gereinigten DNA gewonnen wurde, ist in Abbildung3 dargestellt. Das Vorhandensein der vier 2 ‘-deoxynucleoside, frei von den RNA-Ribonucleo-Seit…

Discussion

Ein großes Problem, das in den 8-oxodGuo-Analysen mit HPLC-Methoden gefunden wird, ist die mögliche Induktion ihrer Formation während der Aufarbeitungsprozesse der DNA-Extraktion,^derDNA-Hydrolyseund der Konzentration von DNA-Hydrolysaten 22,38^. Um das Problem der 8-oxodGuo-Kunstbildung zu minimieren, wird empfohlen, alle DNA-Extraktions-, Speicher-und Hydrolysee-Lösungen mit Deferoxamin zu ergänzen, die Natrium-Jod-Chaotropic-Methode zu verwenden und Phenol …

Materials

[15N5]-2’-deoxyadenosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3895-25
[15N5]-2’-deoxyguanosine	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-3899-CA-10
acetonitrile	Carlo Erba Reagents	412413000
alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa	Sigma	P5521
ammonium acetate	Merck	101116
calf thymus DNA	Sigma	D1501
cell lysis solution	QIAGEN	158908
chloroform	Carlo Erba Reagents	412653
deferoxamine	Sigma	D9533
deoxyribonuclease I (DNase I)	Bio Basic Inc	DD0649
ethanol	Carlo Erba Reagents	414542
formic acid	Sigma-Aldrich	F0507
HPLC-ESI-MS/MS system	HPLC: Agilent 1200 series            ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments	HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).                                                            ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.
HPLC/DAD system	Shimadzu	Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)
HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 µm, C18)	Phenomenex	00B-4446-B0
HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 µm, C18)	Phenomenex	00F-4251-B0
HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 µm, C18)	Phenomenex	00G-4252-E0
HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)	Phenomenex	AJO-4287
isoamyl alcohol	Sigma-Aldrich	M32658
isopropyl alcohol (isopropanol)	Carlo Erba Reagents	A412790010
ketamine	Ceva	Commercial name: Dopalen
magnesium chloride	Carlo Erba Reagents	349377
magnesium chloride	Sigma	M2393
methanol	Carlo Erba Reagents	L022909K7
phosphodiesterase I from Crotalus atrox	Sigma	P4506
protein precipitation solution	QIAGEN	158912
proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
ribonuclease A	Sigma	R5000
sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9625
SPE-C18 (Strata-X)	Phenomenex	8B-S100-TAK
tris(hydroxymethyl)-aminomethane	Carlo Erba Reagents	489983
xylazine	Syntec do Brasil	Commercial name: Xilazin