الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط
Summary
ترتبط تجارب البروتين المجهري الملزم (PBM) المقترنة باختبارات الكيمياء الحيوية بالخصائص الملزمة والمحفزة للحمض النووي البدائي ، وهو انزيم يجمع الإشعال الريبي علي الحمض النووي. ويمكن استخدام هذه الطريقة ، التي تم تعيينها كتنميط بدائي عالي الانتاجيه (HTPP) ، للكشف عن أنماط ربط الحمض النووي لمجموعه متنوعة من الانزيمات.
Abstract
الحمض النووي البدائي توليف الإشعال RNA قصيرة التي تبدا تخليق الحمض النووي من شظايا Okazaki علي حبلا متخلفه من قبل الحمض النووي البوليميريز خلال النسخ المتماثل DNA. والربط بين البدائيات ذات النواة الحقيقية الشبيهة بالحمض النووي في الدنا يحدث عند تسلسل معين للاعتراف بالكروموسومات الثلاثية. وهي خطوه محوريه في تشكيل شظايا اوكازاكي. الاداات البيوكيميائية التقليدية التي تستخدم لتحديد تسلسل التعرف علي الحمض النووي من الحمض النووي البدائي توفر فقط معلومات محدوده. باستخدام المقايسة الدقيقة العالية الانتاجيه المستندة إلى ميكروصفيف والتحليلات البيوكيميائية المتتابعة ، فقد تبين ان 1) السياق ملزمه محدده (الربط متواليات من موقع الاعتراف) يؤثر علي قوه ملزمه من الحمض النووي البدائي إلى قالبه الحمض النووي ، و 2) اقوي ملزمه من البدائية إلى الحمض النووي غله أطول الجيش النيبالي العالي الإشعال ، مشيرا إلى ارتفاع المستقيم من الانزيم. ويجمع هذا الأسلوب بين الفحص الدقيق والنشاط البدائي ويتم تعيينه كتصنيف بدائي عالي الانتاجيه (HTPP) ، ويسمح بتوصيف التعرف علي تسلسل محدد بواسطة الحمض النووي البدائي في وقت وقابليه غير مسبوقين.
Introduction
HTPP يجعل استخدام الحمض النووي ربط التكنولوجيا الدقيقة مع التحليل البيوكيميائي (الشكل 1) لتحديد إحصائيا ميزات محدده من قوالب الحمض النووي التي تؤثر علي النشاط الانزيمي من الحمض النووي البدائي. ولذلك ، يوفر HTPP منصة التكنولوجية التي تسهل قفزه المعرفة في الميدان. الاداات الكلاسيكية المستخدمة لتحديد مواقع التعرف علي البدائية لا تملك القدرة علي الغلة كميه هائله من البيانات ، في حين HTPP لا.
PBM هي تقنيه تستخدم بشكل روتيني لتحديد التفضيلات الملزمة لعوامل النسخ إلى الحمض النووي1,2; ومع ذلك ، فانه ليس مناسبا للكشف عن ضعف/عابره ملزمه من البروتينات إلى الحمض النووي. علي عكس PBM العالمية التي توفر معلومات حول متوسط البروتين ربط الخصوصية لجميع تسلسل ممكن تتكون من ثمانيه أزواج الاساسيه ، ويستند HTPP علي مكتبه قوالب الحمض النووي واحده تقطعت بها السبل تتالف من عناصر تسلسل فريدة من نوعها. وتشمل هذه العناصر تسلسل الحمض النووي عشرات آلاف قصيرة (بضع عشرات من bp) متواليات الجينوم ، فضلا عن التصميم المحوسب متواليات الحمض النووي المخصب في بعض عناصر التسلسل المتكرر الحمض النووي الموجودة في الجينوم ، والتي تمتلك مختلف المحتوي GC متوسط . ويسمح هذا النهج العالي الانتاجيه بتحديد الخصائص المرتبطة بالتسلسل التي تعتبر مهمة للربط البدائي ونشاطه الانزيمي3، بطريقه منهجيه وكميه وقائمه علي الفرضيات. علي وجه الخصوص ، تم تحديد الصلة الهامه بين التفضيلات الملزمة للحمض النووي البدائي ، (التضمين بواسطة تسلسل الحمض النووي الذي يحيط بمواقع ربط ثلاثي النوكليوتيد المحددة) والمستقيم البدائي لهذا النظام الانزيمي4.
تم تطبيق التكنولوجيا الجديدة لأعاده النظر في فهمنا لمواقع التعرف علي البدائية حتى بالنسبة T7 الحمض النووي البدائية التي تم دراستها علي نطاق واسع5. وعلي وجه التحديد ، أدت أعاده النظر في المفاهيم الكلاسيكية ، مثل مواقع التعرف علي الحمض النووي T7 الحمض النووي البدائي (التي تم تحديدها قبل أربعه عقود تقريبا 6) باستخدام البروتين الحمض النووي ملزمه ميكروصفيف (PBM) إلى رؤية غير مسبوقة في الميزات المتعلقة التسلسل [فلكينغ] من هذا تمييز موقعات3. وكان من المتوقع ان التسلسل الذي يحيط بموقع الاعتراف ثلاثي النوكليوتيد من T7 DNA بريتاز (5 ‘-GTC-3 ‘) سيكون عشوائيا. بدلا من ذلك ، وجدنا ان المتواليات الغنية TG التي تزيد من فرص T7 الحمض النووي البدائية لتوليف الإشعال الجيش الملكي النيبالي أطول تشير إلى زيادة في processivity.
وتشمل الطرق الأخرى التي يمكن استخدامها لدراسة خصائص ربط الحمض النووي من البروتينات في المختبر اختبار تحول الحركة الكهربية (EMSA)7، dnase انا الطباعة علي الاقدام8، السطح-PLASMON الرنين (موارد الاستخدام الخاصة)9، وجنوب غرب التنقيط 10. ومع ذلك ، فان أساليب الانتاجيه المنخفضة تنطبق فقط علي التحقيق في عدد صغير من تسلسل الحمض النووي. الاضافه إلى ذلك ، فان دقه وحساسية بعض هذه التقنيات (مثل EMSA) منخفضه. من ناحية أخرى ، في المختبر الاختيار11 هو الأسلوب الذي ، بالمثل لل PBM ، يمكن استخدامها لتحديد العديد من تسلسل ملزمه. ومع ذلك ، عاده ما تستبعد تسلسلات تقارب منخفضه في معظم تطبيقات الاختيار في المختبر. ولذلك ، فان هذا النهج غير مناسب للحصول علي بيانات الربط المقارن لجميع التسلسلات المتاحة. ويستخدم العالمية PBM1,2 أساسا لتوصيف الخصائص الملزمة لعوامل النسخ من النوى البدائية والنواة وكذلك عوامل محدده (علي سبيل المثال ، وجود بعض ligands ، والعوامل المختلطة ، وما إلى ذلك) التي قد تؤثر علي هذا التفاعل12.
HTPP يوسع تطبيق PBM لانزيمات معالجه الحمض النووي من خلال الجمع بين الطاقة الاحصائيه عاليه الانتاجيه غير مسبوقة مع دقه عاليه لتوفير معلومات حول سياق تسلسل الربط. ولم يتم بعد الحصول علي هذه البيانات بالنسبة للبدائيات والانزيمات ذات الصلة (التي لها ارتباط ضعيف/عابر بالحمض النووي) بسبب القيود التقنية المذكورة أعلاه للتقنيات المتاحة الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت طريقه PBM علي نطاق واسع للتحقيق في خصائص ملزمه لعوامل النسخ ويمكن أيضا ان تطبق علي انزيمات معالجه الحمض النووي ، مثل الحمض النووي البدائي ، التي ترتبط الحمض النووي مع تقارب منخفضه. غير انه يلزم إدخال بعض التعديلات علي الإجراءات التجريبية. وتشمل تجربه ميكروصفيف عده خطوات: تصميم م…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا البحث بدعم مؤسسه العلوم الاسرائيليه (المنحة رقم 1023/18).
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
Riferimenti
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
- Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
- Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
- Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
- Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).
