Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento
Summary
Los experimentos de microarray de unión a proteínas (PBM) combinados con ensayos bioquímicos vinculan las propiedades lácteas y catalíticas de la primasa de ADN, una enzima que sintetiza los imprimadores de ARN en el ADN de la plantilla. Este método, designado como perfilado de primas de alto rendimiento (HTPP), se puede utilizar para revelar patrones de unión al ADN de una variedad de enzimas.
Abstract
DNA primase sintetiza imprimaciones cortas de ARN que inician la síntesis de ADN de fragmentos de Okazaki en la hebra rezagada por ADN polimerasa durante la replicación del ADN. La unión de primas procariotas similares a DnaG al ADN se produce en una secuencia de reconocimiento de trinucleótidos específica. Es un paso fundamental en la formación de fragmentos de Okazaki. Las herramientas bioquímicas convencionales que se utilizan para determinar la secuencia de reconocimiento de ADN de la primasa del ADN proporcionan sólo información limitada. Utilizando un ensayo de unión basado en microarrays de alto rendimiento y análisis bioquímicos consecutivos, se ha demostrado que 1) el contexto de unión específico (secuencias de flanqueo del sitio de reconocimiento) influye en la fuerza de unión de la primasa de ADN a su plantilla EL ADN, y 2) la unión más fuerte de la primasa al ADN produce imprimaciones de ARN más largas, lo que indica una mayor procesatividad de la enzima. Este método combina el ensayo de actividad de PBM y primase y se designa como perfilado de primas de alto rendimiento (HTPP), y permite la caracterización del reconocimiento de secuencia específica por primas aganlos en un tiempo y escalabilidad sin precedentes.
Introduction
HTPP hace uso de la tecnología de microarray de unión al ADN combinada con el análisis bioquímico(Figura 1) para identificar estadísticamente características específicas de las plantillas de ADN que afectan a la actividad enzimática de la primasa del ADN. Por lo tanto, HTPP proporciona una plataforma tecnológica que facilita un salto de conocimiento en el campo. Las herramientas clásicas utilizadas para determinar sitios de reconocimiento de primas no tienen la capacidad de producir una gran cantidad de datos, mientras que HTPP sí.
PBM es una técnica utilizada rutinariamente para determinar las preferencias de unión de los factores de transcripción al ADN1,2; sin embargo, no es adecuado para la detección de la unión débil / transitoria de proteínas al ADN. A diferencia del PBM universal que proporciona información sobre la especificidad media de unión a proteínas a todas las secuencias posibles que consisten en ocho pares de base, HTPP se basa en la biblioteca de plantillas de ADN de una sola cadena que comprende elementos de secuencia únicos. Estos elementos de secuencia de ADN implican decenas de miles de secuencias genómicas cortas (pocas decenas de bp), así como secuencias de ADN diseñadas computacionalmente enriquecidas en ciertos elementos de secuencia repetitiva de ADN presentes en el genoma, que poseen diferentes contenidos promedio de GC . Este enfoque de alto rendimiento permite determinar, de forma sistemática, cuantitativa y basada en hipótesis, las propiedades relacionadas con la secuencia que son importantes para la unión de primas y su actividad enzimática3. En particular, se ha identificado el importante vínculo entre las preferencias de unión a primas-ADN (moduladas por secuencias de ADN que flanquean sitios específicos de unión a trinucleótidos) y la procesatividad de la primas para este sistema enzimático4.
La nueva tecnología se aplicó para revisar nuestra comprensión de los sitios de reconocimiento de primas, incluso para la primasa de ADN T7 que ha sido ampliamente estudiada5. Específicamente, el reexamen de conceptos clásicos, como los sitios de reconocimiento de ADN de la primasa tensa T7 (que se determinaron hace casi cuatro décadas 6) utilizando microarray de unión a proteínas y ADN (PBM) ha dado lugar a una visión sin precedentes de las características relacionadas con la secuencia de flanqueo de estos sitios de reconocimiento3. Se esperaba que las secuencias que flanquean el sitio de reconocimiento de trinucleótidos de t7 ADN primas (5′-GTC-3′) sean aleatorios. En su lugar, encontramos que las secuencias de flanqueo ricas en TG aumentan las posibilidades de que la primasa de ADN T7 sintete imprimaciones de ARN más largas que indiquen un aumento en la procesabilidad.
Otros métodos que se pueden utilizar para estudiar las propiedades de unión al ADN de las proteínas in vitro incluyen el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)7, DNase I huella8, resonancia de plán (SPR)9, y hincha del sudoeste 10. Sin embargo, estos son métodos de bajo rendimiento sólo aplicables a la investigación de un pequeño número de secuencias de ADN. Además, la precisión y sensibilidad de algunas de estas técnicas (por ejemplo, EMSA) es baja. Por otro lado, la selección in vitro11 es una técnica que, de forma similar a PBM, puede utilizarse para la identificación de numerosas secuencias de unión. Sin embargo, las secuencias de baja afinidad generalmente se excluyen en la mayoría de las aplicaciones de selección in vitro; por lo tanto, este enfoque no es adecuado para obtener datos vinculantes comparativos para todas las secuencias disponibles. El PBM1universal,2 se utiliza principalmente para caracterizar las especificidades vinculantes de los factores de transcripción de prokaryotes y eucariotas, así como factores específicos (por ejemplo, presencia de ciertos ligandos, cofactores, etc.) que pueden afectan a esta interacción12.
HTPP expande la aplicación PBM a las enzimas de procesamiento de ADN mediante la combinación de potencia estadística de alto rendimiento sin precedentes con alta precisión para proporcionar información sobre el contexto de secuencia de enlace. Estos datos aún no se han obtenido para los primas y enzimas relacionadas (que tienen una unión débil/transitoria al ADN) debido a las limitaciones técnicas antes mencionadas de otras técnicas disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método PBM se ha utilizado ampliamente para investigar las propiedades de unión de los factores de transcripción y también se puede aplicar a enzimas de procesamiento de ADN, como la primasa del ADN, que se unen al ADN con baja afinidad. Sin embargo, se requieren ciertas modificaciones de los procedimientos experimentales. El experimento de microarray implica varios pasos: diseño de la biblioteca de ADN, preparación del chip, unión de la diana proteica, etiquetado fluorescente y escaneo. Los pasos de lavado lev…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (concesión No 1023/18).
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
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| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
Riferimenti
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- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
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