DNA序列识别利用高通量原酶分析的DNAPrimase
Summary
蛋白质结合微阵列（PBM）实验与生化测定相结合，将DNA原蛋白酶的结合和催化特性联系起来，DNA原蛋白酶是一种在模板DNA上合成RNA引体的酶。该方法被指定为高通量原发性酶分析（HTPP），可用于揭示各种酶的DNA结合模式。
Abstract
脱氧核糖核酸（DNA）原始酶合成短RNA引物，在DNA复制过程中通过DNA聚合酶启动Okazaki片段的DNA合成。原核DnaG样原蛋白酶与DNA结合发生在特定的三核苷酸识别序列中。这是冈崎碎片形成的关键一步。用于确定DNA原生酶DNA识别序列的传统生化工具只提供了有限的信息。使用高通量微阵列结合测定和连续生化分析，已经表明1）特定的结合背景（识别部位的粘结序列）影响DNA原发性酶与其模板的结合强度脱氧核糖核酸（DNA）和2）使原性酶与DNA结合得更强烈，从而产生更长的RNA引结，表明酶的工艺性更高。该方法结合了PBM和原发酶活性测定，被指定为高通量原发性酶分析（HTPP），允许在前所未有的时间和可扩展性下，通过DNA原发酶对特定序列识别进行表征。
Introduction
HTPP利用DNA结合微阵列技术与生化分析相结合（图1），从统计学上识别影响DNA原发酶酶酶活性的DNA模板的具体特征。因此，HTPP 提供了一个技术平台，有助于该领域的知识飞跃。用于确定原始酶识别站点的经典工具无法生成大量数据，而 HTPP 则无法生成。
PBM是一种常用的技术，用于确定转录因子与DNA1、2的结合偏好;然而，它不适合检测蛋白质与DNA的弱/瞬态结合。与向由八个碱基对组成的所有可能序列提供平均蛋白质结合特异性信息的通用 PBM 不同，HTPP 基于包含独特序列元素的单链 DNA 模板库。这种DNA序列元素涉及数以万计的短（几十bp）基因组序列，以及计算设计的DNA序列，这些序列丰富于基因组中某些DNA重复序列元素中，这些序列具有不同的平均GC含量.这种高通量方法允许以系统、定量和假设驱动的方式确定对原性酶结合及其酶活性3重要的序列相关属性。特别是，在这种酶系4中，已确定了原始酶-DNA结合偏好（由DNA序列在特定的三核苷酸结合位点两侧调节）和原始酶过程性之间的重要联系。
这项新技术被应用来重新审视我们对灵酶识别位点的理解，甚至对于T7DNA原性酶，已经被广泛研究5。具体来说，重新审查经典概念，如T7 DNA原发酶的DNA识别位点（这是近40年前确定6）使用蛋白质-DNA结合微阵列（PBM）已导致前所未有的洞察与这些识别站点的侧翼序列3。预计T7DNA原发酶（5′-GTC-3’）三核苷酸识别位点两侧的序列将是随机的。相反，我们发现TG丰富的侧翼序列增加了T7 DNA原始酶合成较长RNA引注的机会，表明工艺性增加。
其他可用于研究体外蛋白质DNA结合特性的方法包括电泳移动转移测定（EMSA）7、DNase I足迹8、表面质子共振（SPR）9和西南印迹10.然而，这些低通量方法只适用于研究少量DNA序列。此外，其中一些技术（例如 EMSA）的精度和灵敏度较低。另一方面，体外选择11是一种技术，与PBM类似，可用于识别许多结合序列。然而，在大多数体外选择应用中，通常排除低亲和序列;因此，此方法不适合获取所有可用序列的比较绑定数据。通用PBM1，2主要用于描述原核生物和真核生物转录因子的结合特性，以及特定因素（例如，某些配体、辅助因子等）可能影响此交互12。
HTPP 将前所未有的高通量统计能力与高精度相结合，提供结合序列上下文的信息，将 PBM 应用扩展到 DNA 处理酶。由于上述其他可用技术的技术限制，尚未获得灵性酶和相关酶（与DNA具有弱/瞬态结合）的数据。
Protocol
Representative Results
Discussion
PBM方法已广泛用于研究转录因子的结合特性，还可用于DNA处理酶，如DNA原发酶，这些酶与低亲和力的DNA结合。然而，实验程序需要某些修改。微阵列实验涉及几个步骤：DNA库的设计、芯片的制备、蛋白质靶点结合、荧光标记和扫描。轻度洗涤步骤至关重要，因为长时间使用含有洗涤剂的溶液会导致蛋白质与DNA模板分离，因为结合的弱/瞬态模式。其他关键步骤包括结合条件（例如，缓冲物组合、辅…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了以色列科学基金会（第1023/18号赠款）的支持。
Materials
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
Riferimenti
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