フローサイトメトリーによるBKポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性の測定
Summary
この原稿では、tdTomatoおよびeGFPを発現する双方向レポータープラスミドをトランスフェクトしたHEK293T細胞を用いてBK-ポリオマウイルス転写活性のFACSベースの測定を行うプロトコルが提示される。この方法はさらに、ウイルス転写に対する新規化合物の影響を定量的に決定することを可能にする。
Abstract
BK-ポリオマウイルス(BKPyV)のようなポリオマウイルスは、免疫不全患者に重篤な病理を引き起こす可能性がある。しかし、現在、非常に効果的な抗ウイルス剤は入手できないため、潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が求められている。ここでは、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする二重蛍光レポーターを構築し、tdTomatoおよびeGFPを介してウイルス遺伝子発現に対する潜在的な抗ウイルス薬の影響を定量化した。式。また、このプロトコルで例示的に得られたBKPyV-NCCRアンプリコンをクローニングすることにより、免疫不全の腎移植患者の血液由来DNAから得られ、NCCR再配列がウイルス遺伝子発現に及ぼす影響を判定することができる。患者由来アンプリコンのクローニング後、HEK293T細胞をレポータープラスミドでトランスフェクトし、潜在的な抗ウイルス剤で治療した。続いて、細胞を平均蛍光強度72hポストトランスフェクションを測定するためのFACS分析を行った。また、潜在的な細胞周期阻害効果を有する薬物の分析をテストするために、トランスフェクトのみ、したがって蛍光細胞が使用される。このアッセイは大きなT抗原発現細胞で行われるので、早期発現と後期発現の影響を相互に独立した方法で分析することができる。
Introduction
ポリオマウイルスは、シミアンウイルス40(SV40)をプロトタイプ種として有する小さな二本鎖DNA(dsDNA)ウイルスの独立したファミリーを表す。一次感染は主に小児期に起こり、通常は疾患症状なしで進行し、通常は免疫有能な宿主で潜伏感染を引き起こす。BK-ポリオマウイルス(BKPyV)は、主に腎管細胞に腎症を引き起こすことなく持続するが、腎移植後の免疫能力の障害の場合、ウイルスは再活性化し、重度の損傷および移植片の障害を引き起こす可能性がある。高ウイルス血症(1 x 104 BKPyV DNAコピー/mL)1、2に達すると機能します。腎臓移植レシピエントのおよそ10%において、BK-ポリオマウイルス(BKPyV)の再活性化は、腎同種移植片障害のリスクが高い80%に関連したポリオマウイルス関連腎症(PyVAN)をもたらす3,4.承認された抗ウイルス剤が利用できないため、現在の治療は免疫抑制の減少に基づいている。興味深いことに、 mTOR 阻害剤は、抗ウイルス効果を持っているようです。;したがって、免疫抑制療法をmTORベースの免疫抑制に切り替えると、BKPyVウイルス血症5、6、7の進行を防ぐための代替アプローチを表しうる。しかし、mTORベースの抗ウイルス機構は現在まだ完全に理解されていない。したがって、臨床的に関連する濃度における潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が必要とされる。
BKPyVの円形ゲノムは、複製の起源として機能する非コード制御領域(NCCR)を約5kbに収容し、それに付き合って早期および後期mRNA転写物の発現を駆動する双方向プロモーターで構成される。自発的に発生するNCCR再配列、欠損、および複製は病原性BKPyV8に見出され、PVAN 5、9に苦しむ患者において有意に蓄積されるので、原型(wt)および再配置された(rr)NCCR活動は、ウイルス複製性の適合性を特徴付けるために有用である。
図1に要約すると、このプロトコルは、レポータープラスミド5から発現した2つの蛍光体tdTomatoおよびeGFPの蛍光を定量することにより、BKPyV NCCR転写活性を測定するために一般的に使用される方法を説明する。9,10,11.この手順は、SV40大型T抗原(lTAg)の存在下で行われ、これは、NCCR活性の早期および後期に対する潜在的な抗ウイルス剤の影響を別々に5に分析することを可能にする。このアッセイは、NCCR活性に対する再配置の影響とwt-NCCR5,9との比較をさらに分析する。レポータープラスミドは、各蛍敵オープンリーディングフレームの下流にあるSV40後期ポリアデニル化信号を、tdTomatoおよびeGFPの両方のトランスクリプトの同等かつ効率的な処理を保証します。qRT-PCRベースの方法5、12と比較して、このFACSベースのアプローチは、感染した細胞培養のための複雑な抽出プロトコルがなく、高価ではないため、低コストで高スループット対応の代替手段を表します。免疫蛍光染色のための抗体が必要です。さらに、フローサイトメトリーを介して定義された量の蛍光細胞を分析するので、細胞周期阻害剤の分析も定量的に可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする一般的に使用される方法が提示される。NCCR活性は同時に測定することができ、トランスフェクトされた細胞のリシスを必要としない。さらに、比較的多くの細胞を分析することができ、蛍光値の正規化のための追加マーカーの共トランスフェクションは必要ありません。
この?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、バーバラ・ブリークマンに優れた技術支援を感謝しています。これらの研究は、デュースブルク・エッセン大学医学部のIFORESプログラムと大学アライアンス・ルール・アンド・メルカトル研究センター・ルール(MERCUR)のRIMURプログラムによって支援されました。著者らは、ヘレネ・セルツニッヒの博士課程のフェローシップと絶え間ない支援に対して、ユルゲン・マンチョット・スティフトゥンに感謝しています。患者材料の収集と使用は、大学デュースブルクエッセン(14-6028-BO)の医学部の倫理委員会によって承認されています。
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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