I detta manuskript, ett protokoll presenteras för att utföra FACS-baserade mätningar av BK-polyomavirus transkriptionell aktivitet genom att använda HEK293T celler transfekterade med en dubbelriktad reporter plasmid uttrycker tdtomato och egfp. Denna metod gör det möjligt att kvantitativt bestämma påverkan av nya föreningar på viral transkription.
Polyomaviruser, som BK-polyomavirus (BKPyV), kan orsaka allvarliga patologier hos patienter med nedsatt immunförsvar. Eftersom mycket effektiva antivirala läkemedel för närvarande inte är tillgängliga krävs dock metoder för att mäta effekten av potentiella antivirala medel. Här har en dubbel fluorescensreporter som gör det möjligt att analysera den icke-kodande kontroll region (NCCR) som är driven i början och slutet av promotorn för att kvantifiera effekten av potentiella antivirala läkemedel på virus genuttryck via tdTomato och eGFP Uttryck. Genom kloning av BKPyV-NCCR-amplikoner som i detta protokoll exemplärt har erhållits från det blodbaserade DNA hos immunsupprimerade njurtransplanterade patienter kan effekten av NCCR-omordningar på viral genuttryck bestämmas. Efter kloning av patienten härledda amplicons, HEK293T celler var transfekterade med rapportör-plasmider, och behandlas med potentiella antivirala medel. Därefter utsattes celler för FACS-analys för mätning av medelvärdet för fluorescensintensiteter 72 h efter transfektion. För att också testa analysen av läkemedel som har en potentiell cell cykelhämmande effekt, endast transfekterade och därmed fluorescerande celler används. Eftersom denna analys utförs i stora T antigen uttrycker celler, effekterna av tidigt och sent uttryck kan analyseras på ett ömsesidigt oberoende sätt.
Polyomaviruses representerar en självständig familj av små dubbelsträngade DNA (dsDNA) virus med Simian virus 40 (SV40) som en prototyp art. Den primära infektionen uppstår främst under barndomen, som vanligtvis fortsätter utan sjukdomssymtom och oftast orsaka latent infektioner i immunförsvaret kompetenta värdar. BK-polyomavirus (BKPyV) består i huvudsak av njurtubuli celler utan att orsaka nefropatier, men i händelse av försämring av immun-kompetensen efter njurtransplantation kan viruset återaktivera och orsaka allvarliga skador och försämrad transplantat funktion när man når en hög viremia (1 x 104 bkpyv DNA kopior/ml)1,2. Hos cirka 10% av mottagarna av njurtransplantat, reaktivering av BK-polyomavirus (bkpyv) resulterar i en polyomavirus associerad nefropati (pyvan), som var upp till 80% förknippad med en hög risk för renal allograffel3,4 . Eftersom inga godkända antivirala medel finns tillgängliga, är nuvarande behandling baserad på reduktion av immunsuppression. Intressant, mTOR-hämmare verkar ha en antiviral effekt; Således, byta immunsuppressiv behandling till mTOR-baserad immunsuppression kan utgöra en alternativ metod för att förhindra progression av bkpyv viremia5,6,7. Men den mTOR-baserade antivirala mekanismen är för närvarande fortfarande ofullständigt förstådd. Därför krävs metoder för att mäta effekten av potentiella antivirala medel i kliniskt relevanta koncentrationer.
Den cirkulära genomet i BKPyV består av cirka 5 KB härbärga en icke-kodning kontroll region (NCCR) som fungerar som ett ursprung för replikering och samtidigt en dubbelriktad promotor kör uttrycket av tidiga och sena fas mRNA utskrifter. Eftersom spontant förekommande nccr-omordningar, borttagningar och dubbleringar påträffas i patogena bkpyv8 och ackumuleras signifikant hos patienter som lider av PVAN-5,9, en jämförelse av arketetypikal (WT) och omarrangerade (RR) NCCR-aktiviteter är till hjälp för att karakterisera viral replikativ kondition.
Som sammanfattas i figur 1, beskriver detta protokoll en metod som ofta används för att mäta BKPyV nccr-transkriptionsaktivitet genom att kvantifiera fluorescensen hos två fluorofomedel tdTomato och egfp som uttrycks från en reporter plasmid5, 9,10,11. Förfarandet utförs i närvaro av SV40 stora T-antigen (lTAg), som gör det möjligt att analysera effekterna av potentiella antivirala medel på tidig och sen NCCR-aktivitet separat5. Denna analys analyserar ytterligare effekten av omordningar på nccr-aktiviteten och jämförelse med WT-nccrs5,9. Reportern plasmid hamnar den SV40 sena polyadenylering signalen nedströms varje fluorophore öppen läsbild för att säkerställa jämförbar och effektiv bearbetning av båda avskrifter för tdTomato och eGFP, respektive. Jämfört med QRT-PCR-baserade metoder5,12, detta FACS-baserade tillvägagångssätt representerar en låg kostnad och hög genomströmning kompatibelt alternativ eftersom inga komplicerade utvinning protokoll för infekterade cellkulturen och inga dyra antikroppar mot immunfluorescens färgning behövs. Dessutom, eftersom en definierad mängd fluorescerande celler analyseras via flödescytometri, är analysen av cell cykelhämmande medel också möjligt på ett kvantitativt sätt.
I den här artikeln presenteras en vanlig metod som gör det möjligt för analys av BKPyV icke-kodning Control-region (NCCR) driven tidig och sen promotor aktivitet. Nccr-aktiviteten kan mätas samtidigt och behöver inte lys av de transfekterade cellerna. Dessutom kan ett relativt stort antal celler analyseras och co-transfektion av ytterligare markörer för normalisering av fluorescensvärden är inte nödvändigt.
En kritisk del av denna metod är att den klonade nccr bör innehålla exak…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Barbara Bleekmann för utmärkt teknisk hjälp. Dessa studier stöttades av IFORES-programet av universitetar av Duisburg-Essen läkarundersökning skolar och RIMUREN-programet av Universitetaralliansen Ruhr och Mercator forskning centrerar Ruhr (MERCUR). Författarna tackar Jürgen-Manchot-Stiftungen för doktorat gemenskap av Helene Sertznig och konstant service. Insamling och användning av patientmaterial har godkänts av etikkommittén för den medicinska fakulteten vid universitetet Duisburg-Essen (14-6028-BO).
100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
AgeI-HF | NEB | R3552 | |
Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
DAPI | Sigma | 10236276001 | |
DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
PBS | Gibco | 14190-136 | |
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
SpeI-HF | NEB | R3133 | |
T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |