Mesure de bk-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry
Summary
Dans ce manuscrit, un protocole est présenté pour effectuer la mesure FACS-basée de bk-polyomavirus activité transcriptionnelle en utilisant des cellules HEK293T transfecté avec un plasmide journaliste bidirectionnel exprimant tdTomato et eGFP. Cette méthode permet en outre de déterminer quantitativement l’influence de nouveaux composés sur la transcription virale.
Abstract
Les polyomavirus, comme le BK-polyomavirus (BKPyV), peuvent causer des pathologies graves chez les patients immunodéprimés. Cependant, comme les antiviraux très efficaces ne sont pas disponibles à l’heure actuelle, des méthodes mesurant l’impact des agents antiviraux potentiels sont nécessaires. Ici, un journaliste à double fluorescence qui permet l’analyse de la région témoin non codante BKPyV (NCCR) conduite tôt et tardivement par l’activité de promoteur a été construit pour quantifier l’impact des médicaments antiviraux potentiels sur l’expression des gènes viraux par l’intermédiaire de tdTomato et eGFP expression. En outre, en clonant des amplicons de BKPyV-NCCR qui dans ce protocole ont été exemplarily obtenus à partir de l’ADN blood-dérivé des patients transplantés rénaux immunocompromis, l’impact des NCCR-réarrangements sur l’expression virale de gène peut être déterminé. Après clonage des amplicons dérivés de patient, les cellules de HEK293T ont été transfected avec les reporter-plasmides, et traitées avec des agents antiviraux potentiels. Par la suite, des cellules ont été soumises à l’analyse FACS pour mesurer les intensités moyennes de fluorescence 72 h après la transfection. Pour tester également l’analyse des médicaments qui ont un effet inhibiteur du cycle cellulaire potentiel, seules les cellules transfectées et donc fluorescentes sont utilisées. Puisque cet analyse est effectué dans de grandes cellules exprimant estomnons de T Antigène, l’impact de l’expression tôt et tard peut être analysé d’une manière mutuellement indépendante.
Introduction
Les polyométavirus représentent une famille indépendante de petits virus de l’ADN à double brin (ADN) avec le virus Simian 40 (SV40) comme espèce prototype. L’infection primaire se produit principalement pendant l’enfance, qui procèdent habituellement sans symptômes de maladie et causent habituellement des infections latentes dans les hôtes immunisés compétents. Le BK-polyomavirus (BKPyV) persiste principalement dans les cellules rénales de tubules sans causer des nephropathologies, cependant, en cas de affaiblissement de la immuno-compétence après transplantation rénale le virus peut réactiver et causer des dommages graves et la greffe altérée fonction lors de l’atteinte d’une virémie élevée (1 x 104 copies d’ADN BKPyV/mL)1,2. Chez environ 10 % des receveurs de greffe sinain, la réactivation du BK-polyomavirus (BKPyV) entraîne une néphropathie associée au polyomavirus (PyVAN), qui était jusqu’à 80 % associée à un risque élevé d’échecs d’allogreffe rénale3,4 . Comme aucun antiviral approuvé n’est disponible, le traitement actuel est basé sur la réduction de l’immunosuppression. Fait intéressant, les inhibiteurs de mTOR semblent avoir un effet antiviral ; ainsi, le passage de la thérapie immunosuppressive à l’immunosuppression mTOR-basée pourrait représenter une approche alternative pour empêcher la progression de la virémie de BKPyV5,6,7. Cependant, le mécanisme antiviral à base de mTOR est actuellement encore incomplet. Ainsi, des méthodes mesurant l’impact d’agents antiviraux potentiels dans des concentrations cliniquement pertinentes sont nécessaires.
Le génome circulaire du BKPyV se compose d’environ 5 kb abritant une région de contrôle non codante (NCCR) qui sert d’origine de la réplication et, en même temps, un promoteur bidirectionnel conduisant à l’expression des transcriptions de l’ARNm de phase précoce et tardive. Puisque les réarrangements, les suppressions et les duplications spontanément se produisant NCCR se trouvent dans LE BKPyV8 pathogène et significativement accumulés dans les patients souffrant de PVAN5,9, une comparaison de l’archétype (wt) et les activités du NCCR réarrangées (rr) sont utiles pour caractériser la condition physique répliquif virale.
Comme résumé à la figure 1, ce protocole décrit une méthode couramment utilisée pour mesurer l’activité transcriptionnelle DU RNC DE BKPyV en quantifiant la fluorescence de deux fluorophores tdTomato et eGFP exprimées à partir d’un plasmide de journaliste5, 9,10,11. La procédure est effectuée en présence de l’antigène T sV40 grand (lTAg), qui permet d’analyser l’impact des agents antiviraux potentiels sur le début et la fin NCCR-activité séparément5. Cet analyse analyse davantage l’impact des réarrangements sur l’activité du NCCR et la comparaison avec les Wt-NCCRs5,9. Le plasmide de journaliste héberge le signal de polyadenylation en retard de SV40 en aval de chaque cadre de lecture ouvert de fluorophore pour assurer le traitement comparable et efficace des deux transcriptions pour tdTomato et eGFP, respectivement. Comparé e aux méthodes qRT-PCR5,12, cette approche basée sur le FACS représente une alternative compatible à faible coût et à haut débit puisqu’aucun protocole d’extraction compliqué pour la culture cellulaire infectée et aucun coût des anticorps pour la coloration de fluorescence immunisée sont nécessaires. En outre, puisqu’une quantité définie de cellules fluorescentes sont analysées par cytométrie de flux, l’analyse des agents inhibiteurs du cycle cellulaire est également possible d’une manière quantitative.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, une méthode couramment utilisée est présentée qui permet l’analyse de la BKPyV non-codage de contrôle-région (NCCR) conduit début et tard l’activité du promoteur. L’activité du NCCR peut être mesurée simultanément et n’a pas besoin de lyse des cellules transfectées. En outre, un nombre relativement important de cellules peut être analysée et la co-transfection de marqueurs supplémentaires pour la normalisation des valeurs de fluorescence n’est pas nécessaire.
<p class="jove_content"…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Barbara Bleekmann pour son excellente assistance technique. Ces études ont été soutenues par le programme IFORES de l’École de médecine de l’Université de Duisburg-Essen et le programme RIMUR de l’Alliance universitaire Ruhr et le Centre de recherche Mercator Ruhr (MERCUR). Les auteurs remercient le Juergen-Manchot-Stiftung pour la bourse de doctorat d’Hélène Sertznig et son soutien constant. La collecte et l’utilisation du matériel patient ont été approuvées par le comité d’éthique de la faculté de médecine de l’Université du Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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