Medición de la actividad transcripcional impulsada por la región de control no codificante BK-polioomavirus a través de la citometría de flujo
Summary
En este manuscrito, se presenta un protocolo para realizar la medición basada en FACS de la actividad transcripcional BK-polioomavirus mediante el uso de células HEK293T transcritas con un plásmido reportero bidireccional que expresa tdTomato y eGFP. Este método permite además determinar cuantitativamente la influencia de nuevos compuestos en la transcripción viral.
Abstract
Los poliomavirus, como el BK-poliomavirus (BKPyV), pueden causar patologías graves en pacientes inmunocomprometidos. Sin embargo, dado que actualmente no se dispone de antivirales altamente eficaces, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales. Aquí, se construyó un reportero de doble fluorescencia que permite el análisis de la región de control no codificante BKPyV (NCCR) impulsada por la actividad promotora temprana y tardía para cuantificar el impacto de los posibles medicamentos antivirales en la expresión génica viral a través de tdTomato y eGFP Expresión. Además, mediante la clonación de los amplicones BKPyV-NCCR que en este protocolo se han obtenido ejemplarmente del ADN derivado de la sangre de pacientes trasplantados renales inmunocomprometidos, se puede determinar el impacto de los reordenamientos del NCCR en la expresión génica viral. Tras la clonación de los amplicons derivados del paciente, las células HEK293T fueron transinfectadas con los plásmidos del reportero y tratadas con posibles agentes antivirales. Posteriormente, las células fueron sometidas a análisis FACS para medir intensidades medias de fluorescencia 72 h después de la transfección. Para probar también el análisis de fármacos que tienen un potencial efecto inhibidor del ciclo celular, sólo se utilizan células transinfectadas y por lo tanto fluorescentes. Dado que este ensayo se realiza en células grandes que expresan el antígeno T, el impacto de la expresión temprana y tardía se puede analizar de una manera mutuamente independiente.
Introduction
Los poliomavirus representan una familia independiente de pequeños virus de ADN de doble cadena (ADN DSDNA) con el virus Simian 40 (SV40) como especie prototipo. La infección primaria ocurre principalmente durante la infancia, que generalmente procede nacones sin síntomas de la enfermedad y generalmente causan infecciones latentes en huéspedes inmunes competentes. El BK-polioomavirus (BKPyV) persiste principalmente en las células de los túbulos renales sin causar nefropatías, sin embargo, en caso de deterioro de la competencia inmunitaria después del trasplante renal, el virus puede reactivarse y causar daños graves e insuficiencia del injerto función al alcanzar una viremia alta (1 x 104 copias de ADN BKPyV/ml)1,2. En aproximadamente el 10% de los receptores de trasplante de riñón, la reactivación del BK-poliomavirus (BKPyV) da como resultado una nefropatía asociada al poliomavirus (PyVAN), que se asoció hasta un 80% con un alto riesgo de fallos de aloinjerto renal3,4 . Dado que no se dispone de agentes antivirales aprobados, el tratamiento actual se basa en la reducción de la inmunosupresión. Curiosamente, inhibidores de mTOR parecen tener un efecto antiviral; por lo tanto, cambiar la terapia inmunosupresora a la inmunosupresión basada en mTOR podría representar un enfoque alternativo para prevenir la progresión de la viremia BKPyV5,6,7. Sin embargo, el mecanismo antiviral basado en mTOR todavía se entiende incompletamente. Por lo tanto, se requieren métodos que midan el impacto de posibles agentes antivirales en concentraciones clínicamente relevantes.
El genoma circular del BKPyV consiste en aproximadamente 5 kb que albergan una región de control no codificante (NCCR) que sirve como origen de la replicación y concomitantemente un promotor bidireccional que impulsa la expresión de transcripciones de ARNm de fase temprana y tardía. Dado que los reordenamientos, deleciones y duplicaciones del NCCR de origen espontáneo se encuentran en el BKPyV8 patógeno y se acumulan significativamente en pacientes que sufren de PVAN 5,9, una comparación de arquetípicos (wt) y re-arreglado (rr) Las actividades del NCCR son útiles para caracterizar la aptitud replicativa viral.
Como se resume en la Figura 1, este protocolo describe un método comúnmente utilizado para medir la actividad transcripcional BKPyV NCCR cuantificando la fluorescencia de dos fluoróforos tdTomato y eGFP expresadas a partir de un reportero plásmido5, 9,10,11. El procedimiento se realiza en presencia del antígeno T grande SV40 (lTAg), que permite analizar el impacto de los posibles agentes antivirales en la actividad temprana y tardía del NCCR por separado5. Este ensayo analiza más a fondo el impacto de los reordenamientos en la actividad del NCCR y la comparación con los WT-NCCRs5,9. El plásmido reportero alberga la señal de poliadenilación tardía SV40 aguas abajo de cada marco de lectura abierto de fluoróforo para asegurar un procesamiento comparable y eficiente de ambas transcripciones para tdTomato y eGFP, respectivamente. En comparación con los métodos basados en qRT-PCR5,12, este enfoque basado en FACS representa una alternativa compatible de bajo costo y alto rendimiento, ya que no hay protocolos de extracción complicados para el cultivo celular infectado y no costoso se necesitan anticuerpos para la tinción de fluorescencia inmune. Además, dado que una cantidad definida de células fluorescentes se analizan a través de la citometría de flujo, el análisis de los agentes inhibidores del ciclo celular también es posible de manera cuantitativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, se presenta un método comúnmente utilizado que permite el análisis de la actividad de promotor estinúo no codificante (NCCR) impulsada por la actividad temprana y tardía del promotor. La actividad del NCCR se puede medir simultáneamente y no necesita lisis de las células transinfectadas. Además, se puede analizar un número relativamente grande de células y no es necesario la co-transfección de marcadores adicionales para la normalización de los valores de fluorescencia.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Barbara Bleekmann por su excelente asistencia técnica. Estos estudios fueron apoyados por el programa IFORES de la Facultad de Medicina de la Universidad de Duisburg-Essen y el programa RIMUR de la Alianza Universitaria Ruhr y Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Los autores agradecen a los J. Manchot-Stiftung por la beca de doctorado de Helene Sertznig y el apoyo constante. La recolección y el uso de material para pacientes ha sido aprobado por el comité de ética de la facultad de medicina de la Universidad Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
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