Måling af BK-Polyomavirus ikke-kodende kontrol region drevet Transkriptional aktivitet via flowcytometri
Summary
I dette manuskript er en protokol præsenteret for at udføre FACS-baserede måling af BK-Polyomavirus transkriptional aktivitet ved hjælp af HEK293T celler transficeret med en tovejs reporter plasmid udtrykker tdtomato og egfp. Denne metode giver yderligere mulighed for at kvantitativt bestemme indflydelsen af nye forbindelser på viral transkriptionen.
Abstract
Polyomaviruser, ligesom BK-Polyomavirus (BKPyV), kan forårsage alvorlige patologier hos immunkompromitterede patienter. Men da der i øjeblikket ikke findes meget effektive antivirale lægemidler, er det nødvendigt at måle, hvilke virkninger potentielle antivirale agenser har. Her blev en dual fluorescens reporter, der tillader analyse af BKPyV non-Coding Control-region (NCCR) drevet tidlig og sen promotor aktivitet, konstrueret til at kvantificere virkningen af potentielle antivirale lægemidler på viral genekspression via tdTomato og eGFP Udtryk. Hertil kommer, ved at klone bkpyv-nccr amplikoner, som i denne protokol er blevet eksemplarisk opnået fra det blod-afledte DNA af immunkompromitterede Nyretransplanterede patienter, virkningen af nccr-rearrangementerne på viral gen udtryk kan bestemmes. Efter kloning af de patient afledte amplicons blev HEK293T celler transficeret med reporter-plasmiderne og behandlet med potentielle antivirale midler. Efterfølgende blev cellerne underkastet FACS-analyse til måling af de gennemsnitlige fluorescens intensiteter 72 h post transfection. For også at teste analysen af lægemidler, der har en potentiel celle cyklus hæmmende virkning, kun transficeret og dermed fluorescerende celler anvendes. Da denne analyse udføres i store T-antigen, der udtrykker celler, kan virkningen af tidlig og sen ekspression analyseres på en gensidigt uafhængig måde.
Introduction
Polyomaviruser repræsenterer en uafhængig familie af små dobbeltstrenget DNA (dsDNA) vira med Simian virus 40 (SV40) som en prototype art. Den primære infektion opstår hovedsageligt i barndommen, som normalt fortsætter uden sygdomssymptomer og normalt forårsage latente infektioner i immunkompetente værter. BK-Polyomavirus (BKPyV) fortsætter hovedsageligt i renale tubuli celler uden at forårsage nefropatologier, men i tilfælde af svækkelse af immun-kompetence efter nyretransplantation virus kan genaktivere og forårsage alvorlige skader og nedsat transplantat Når der opnås en høj observeres (1 x 104 bkpyv DNA-kopier/ml)1,2. Hos ca. 10% af Nyretransplanterede patienter, reaktivering af BK-Polyomavirus (bkpyv) resulterer i en Polyomavirus associeret nefropati (pyvan), som var op til 80% forbundet med en høj risiko for renal allograft fejl3,4 . Da der ikke findes godkendte antivirale midler, er den aktuelle behandling baseret på reduktion af immunsuppression. Interessant, mTOR-hæmmere synes at have en antiviral effekt; således, at skifte den Immunsuppressive behandling til MTOR-baseret immunsuppression kan repræsentere en alternativ tilgang til at forhindre progression af bkpyv observeres5,6,7. Men den mTOR-baserede antiviral mekanisme er i øjeblikket stadig ufuldstændigt forstået. Der kræves således metoder til måling af virkningen af potentielle antivirale stoffer i klinisk relevante koncentrationer.
Bkpyv’s cirkulære genom består af ca. 5 KB, der harkedeligt et ikke-kodende kontrolområde (NCCR), som fungerer som et udgangspunkt for replikation og samtidig en tovejs promotor, som kører ekspressionen af tidlige og sene fase mRNA-udskrifter. Da spontant forekommende nccr-rearrangementer, sletninger og duplikationer findes i patogene bkpyv8 og signifikant akkumuleret hos patienter, der lider af pvan5,9, en sammenligning af arketetypiske (WT) og omarrangerede (RR) NCCR-aktiviteter er nyttige til at karakterisere viral replikerende fitness.
Som opsummeret i figur 1beskriver denne protokol en almindeligt anvendt metode til at måle BKPyV NCCR transkriptional aktivitet ved at kvantificere fluorescensen af to fluorophores tdTomato og egfp udtrykt fra en reporter plasmid5, 9,10,11. Proceduren udføres i nærværelse af SV40 store T-antigen (lTAg), som gør det muligt at analysere virkningen af potentielle antivirale midler på den tidlige og sene NCCR-aktivitet separat5. Denne analyse analyserer yderligere virkningen af rearrangementerne på nccr-aktiviteten og sammenligningen med WT-nccrs5,9. Reporter plasmid huser det SV40 sene polyadenyleringssignal nedstrøms for hver fluoroforet åben læse ramme for at sikre sammenlignelig og effektiv behandling af begge udskrifter for henholdsvis tdtomato og egfp. Sammenlignet med QRT-PCR baserede metoder5,12, denne FACS-baserede tilgang repræsenterer en lav pris og høj gennemløb kompatibelt alternativ, da ingen komplicerede ekstraktions protokoller for inficeret cellekultur og ingen dyre antistoffer mod immunfluorescens farvning er nødvendige. Da en defineret mængde fluorescerende celler analyseres via flowcytometri, er analysen af celle cyklus hæmmende midler også mulig på en kvantitativ måde.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel præsenteres en almindeligt anvendt metode, der giver mulighed for analyse af BKPyV non-Coding Control-region (NCCR) drevet tidlig og sen promotor aktivitet. Nccr-aktiviteten kan måles samtidigt og behøver ikke lyse af de transficeret celler. Desuden kan et relativt stort antal celler analyseres og co-transfection af yderligere markører for normalisering af fluorescens værdier er ikke nødvendig.
En kritisk del af denne metode er, at den klonede nccr bør indeholde nøjagti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Barbara Bleekmann for fremragende teknisk assistance. Disse undersøgelser blev støttet af IFORES-programmet for universitetet i Duisburg-Essen Medical School og RIMUR-programmet for University Alliance Ruhr og Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Forfatterne takker Jürgen-Manchot-Stiftung for det ph. d.-stipendium, som Helene Sertznig og den konstante støtte har. Indsamlingen og anvendelsen af patientmateriale er blevet godkendt af den etiske komité for det medicinske fakultet ved universitetet Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% – EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
Riferimenti
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
