Måling av BK-polyomavirus ikke-Coding Control region drevet Transcriptional aktivitet via Flow flowcytometri

Summary

I dette manuskriptet presenteres en protokoll for å utføre FACS-basert måling av BK-polyomavirus transcriptional aktivitet ved å bruke HEK293T celler transfekterte med en toveis reporter plasmider som uttrykker tdTomato og eGFP. Denne metoden videre gjør det mulig å kvantitativt bestemme innflytelsen av romanen forbindelser på viral transkripsjon.

Abstract

Polyomaviruses, som BK-polyomavirus (BKPyV), kan forårsake alvorlige sykdommer hos immunsupprimerte pasienter. Men, siden svært effektive antivirale midler er for øyeblikket ikke tilgjengelig, metoder måle effekten av potensielle antivirale midler er nødvendig. Her, en dual fluorescens reporter som gjør at analysen av BKPyV ikke-koding kontroll-regionen (NCCR) drevet tidlig og sent promoter aktivitet ble konstruert for å kvantifisere effekten av potensielle antivirale legemidler på viral genuttrykk via tdTomato og eGFP Uttrykk. I tillegg, ved kloning BKPyV-NCCR amplicons som i denne protokollen har blitt eksempelvis innhentet fra blod-avledet DNA av immunsupprimerte nyretransplanterte pasienter, kan virkningen av NCCR-rearrangements på viral genuttrykk bestemmes. Etter kloning av pasienten avledet amplicons, HEK293T celler ble transfekterte med reporter-plasmider, og behandlet med potensielle antivirale midler. Deretter ble celler utsatt for FACS-analyse for måling bety fluorescens intensitet 72 h post transfeksjoner. Å også teste analyse av legemidler som har en potensiell celle syklus hemmende effekt, bare transfekterte og dermed fluorescerende celler brukes. Siden denne analysen er utført i store T antigen uttrykke celler, kan virkningen av tidlig og sent uttrykk analyseres på en gjensidig uavhengig måte.

Introduction

Polyomaviruses representerer en uavhengig familie av små dobbel-strandet DNA (dsDNA) virus med Simian virus 40 (SV40) som en prototype arter. Den primære infeksjonen oppstår hovedsakelig i løpet av barndommen, som vanligvis går uten sykdomssymptomer og vanligvis forårsake latente infeksjoner i uimottakelig kompetente verter. Den BK-polyomavirus (BKPyV) hovedsakelig vedvarer i renal tubuli celler uten å forårsake nephropathologies, men i tilfelle av svekkelse av immun-kompetanse etter nyre transplantasjon viruset kan reaktivere og forårsake alvorlige skader og nedsatt pode funksjon når man når en høy viremia (1 x 10⁴ BKPyV DNA eksemplarer/ml)^1,2. I ca 10% av nyre transplantasjon mottakere, reaktivering av BK-polyomavirus (BKPyV) resulterer i en polyomavirus assosiert nefropati (PyVAN), som var opp til 80% assosiert med en høy risiko for nyres allograft svikt^3,4 . Siden ingen godkjente antivirale midler er tilgjengelig, er aktuell behandling basert på reduksjon av immunsuppresjon. Interessant, mTOR hemmere synes å ha en antiviral effekt; Dermed kan det å bytte immunsuppressiv-behandlingen til mTOR-baserte immunsuppresjon representere en alternativ tilnærming for å hindre progresjon av BKPyV viremia^5,6,7. Imidlertid, det mTOR-basert antiviral mekanikk er aktuelle fremdeles ufullstendig forstod. Dermed kreves metoder som måler virkningen av potensielle antivirale midler i klinisk relevante konsentrasjoner.

Den sirkulære Genova av BKPyV består av ca 5 kb harboring en ikke-koding kontroll region (NCCR) som fungerer som en opprinnelse av replikering og samtidig en toveis promoter kjører uttrykk for tidlig og sent fase mRNA transkripsjoner. Siden spontant forekommende NCCR-rearrangements, slettinger og duplikasjoner finnes i patogene BKPyV⁸ og signifikant akkumulert hos pasienter som lider av PVAN^5,9, en sammenligning av arketypiske (WT) og re-arrangert (RR) NCCR-aktiviteter er nyttig å karakterisere viral replicative fitness.

Som oppsummert i figur 1, beskriver denne protokollen en vanlig brukt metode for å måle BKPyV NCCR transcriptional aktivitet ved kvantifisere fluorescens av to fluorophores TdTomato og eGFP uttrykt fra en reporter plasmider^{5, 9,10,11}. Prosedyren utføres i nærvær av SV40 store T antigen (lTAg), som gjør det mulig å analysere virkningen av potensielle antivirale midler på tidlig og sent NCCR-aktivitet separat⁵. Denne analysen analyserer videre virkningen av rearrangements på NCCR aktivitet og sammenligning med WT-NCCRs^5,9. Reporteren plasmider havner i SV40 sent polyadenylation signal nedstrøms for hver fluoroforen åpne lese ramme for å sikre sammenlignbare og effektiv behandling av både transkripsjoner for tdTomato og eGFP, henholdsvis. Sammenlignet med qRT-PCR baserte metoder^5,12, denne FACS-basert tilnærming representerer en lav kostnad og høy gjennomstrømming kompatibelt alternativ siden ingen kompliserte utvinning protokoller for infiserte cellekultur og ingen dyre antistoffer for immun fluorescens farging er nødvendig. Videre, siden en definert mengde fluorescerende celler er analysert via Flow flowcytometri, analyse av celle syklus hemme agenter er også mulig i en kvantitativ måte.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene for menneskelig forskning som godkjent av ethic Committee av medisinsk fakultet ved Universitetet i Duisburg-Essen (14-6028-BO). 1. innsamling av blod-eller urinprøver og isolering av polyomavirus DNA Samle minst 3 mL blod i EDTA-rør eller urin i oppkjøpet rør. Sentrifuger prøven ved 2 500 x g i 15 min. Hvis nødvendig, pipette plasma inn i et nytt rør og oppbevar plasma prøvene ved 4 ° c i flere dager eller fryse v…

Representative Results

I dette representative eksperimentet ble BK-polyomavirus non-Coding Control region drevet transcriptional aktivitet målt via strømnings flowcytometri. I tillegg, en mTOR inhibitor, som kan brukes til å behandle pasienter etter BKPyV reaktivering, ble testet for sin hemming av viral tidlig genuttrykk. For å gjøre dette, en dual fluorescens-reporter analysen ble brukt som publisert tidligere5. Det generelle arbeidsflytoppsettet for det eksperimentelle oppsettet …

Discussion

I denne artikkelen presenteres en ofte brukt metode som gjør det mulig for analyse av BKPyV ikke-koding kontroll-region (NCCR) drevet tidlig og sent promoter aktivitet. Den NCCR aktivitet kan måles samtidig og trenger ikke lyse av transfekterte celler. Videre kan et relativt stort antall celler bli analysert og co-transfeksjoner av ekstra markører for normalisering av de fluorescens verdiene er ikke nødvendig.

En kritisk del av denne metoden er at klonet NCCR skal inneholde nøyaktig de sa…

Materials

100 bp ladder	NEB	N3231	Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted
2-log ladder	NEB	N0550	Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	can be substituted by any manufacturer
BD FACSCanto™ II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
DFC450C camera module	Leica		Any camera can be used
DMEM	Gibco	41966-029	can be substituted by any manufacturer
DMIL LED microscope	Leica		Any fluorescence microscope can be used
DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	can be substituted by any manufacturer
E.coli DH5alpha Competent Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	Any FBS can be used
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		Any flow cytometry software FBS can be used
Gel Loading Dye, Purple (6X)	NEB	B7024	Any 6x loading dye can be substituted
HEK293T cells	ATCC	11268	These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability.
HERAcell® 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific		can be substituted by any manufacturer
HotStar PCR kit	Qiagen	203203
Intas Gel documentation system	Intas		Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used
Low Melt Agarose	Biozym	850081	can be substituted by any manufacturer
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	can be substituted by any manufacturer
pBKV (34-2)	ATCC	45025	Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler	Bio-Rad	discontinued product	Any thermocycler can be used
PCR Nucleotide Mix, 10 mM	Promega	#C1145	can be substituted by any manufacturer
PCR1 and PCR2 Primers	metabion	not applicable	Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	can be substituted by any manufacturer
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
Trypsin 0.05% – EDTA	Gibco	25300-054	can be substituted by any manufacturer
ZymoPURE II Plasmid Kit	Zymo	D4201	can be substituted by any manufacturer