In questo manoscritto, viene presentato un protocollo per eseguire la misurazione basata su FACS dell'attività trascrizionale BK-poliomavirus utilizzando cellule HEK293T trascate da un plasmide reporter bidirezionale che esprime tdTomato ed eGFP. Questo metodo permette inoltre di determinare quantitativamente l'influenza di nuovi composti sulla trascrizione virale.
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Articolo metodologico
Misurazione di BK-poliomavirus Non-Coding Control Region Guidato Attività Trascrizionional Via Flusso Cytometry
In questo articolo
Sommario
Abstract
I poliomavirus, come il BK-poliomavirus (BKPyV), possono causare gravi patologie nei pazienti immunocompromessi. Tuttavia, poiché attualmente non sono disponibili antivirali altamente efficaci, sono necessari metodi che misurano l'impatto di potenziali agenti antivirali. Qui, è stato costruito un reporter a doppia fluorescenza che consente l'analisi dell'attività di promotrice bKPyV basata sulla regione di controllo non codificante (NCCR) in anticipo e in ritardo per quantificare l'impatto di potenziali farmaci antivirali sull'espressione genica virale tramite tdTomato ed eGFP espressione. Inoltre, clonando gli amplificatori BKPyV-NCCR che in questo protocollo sono stati esemplificati dal DNA derivato dal sangue dei pazienti trapiantati renali immunocompromessi, è possibile determinare l'impatto dei riarrangiamenti NCCR sull'espressione genica virale. Dopo la clonazione del paziente derivato amplicons, le cellule HEK293T sono state trascate con il reporter-plasmidi e trattate con potenziali agenti antivirali. Successivamente, le cellule sono state sottoposte all'analisi FACS per misurare le intensità medie di fluorescenza 72 h dopo la trasfezione. Per testare anche l'analisi dei farmaci che hanno un potenziale effetto di inibizione del ciclo cellulare, vengono utilizzate solo cellule trasfette e quindi fluorescenti. Poiché questo saggio viene eseguito in grandi cellule che esprimono l'antigene T, l'impatto dell'espressione precoce e tardiva può essere analizzato in modo reciprocamente indipendente.
Introduzione
I poliomavirus rappresentano una famiglia indipendente di piccoli virus di DNA a doppio filamento (dsDNA) con il virus Simian 40 (SV40) come specie prototipo. L'infezione primaria si verifica principalmente durante l'infanzia, che di solito procede senza sintomi di malattia e di solito causano infezioni latenti in ospiti immunitari competenti. Il BK-poliomavirus (BKPyV) persiste principalmente nelle cellule dei tubuli renali senza causare nefropatologie, tuttavia, in caso di compromissione della competenza immunitaria dopo il trapianto renale il virus può riattivarsi e causare gravi danni e alterati innesti quando si raggiunge una viremia alta (1 x 104 BKPy....
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Protocollo
Questo protocollo segue le linee guida della ricerca umana, come approvato dal comitato etico della facoltà di medicina dell'Università di Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. Raccolta di campioni di sangue o urina e isolamento del DNA poliomavirus
- Raccogliere almeno 3 mL di sangue in tubi EDTA o urina in tubi di acquisizione.
- Centrifugare il campione a 2.500 x g per 15 min. Se necessario, pipetta plasma in un nuovo tubo e conservare i campioni di plasma a 4 gradi centigradi per diversi giorni o congelare a -20 gradi per un deposito più lungo.
- Preparate 40 l di proteine assi K in un tubo di microcentrismo d....
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Risultati
In questo esperimento rappresentativo, l'attività trascrizionale guidata dalla regione di controllo non codificabil Inoltre, un inibitore mTOR, che potrebbe essere usato per trattare i pazienti dopo la riattivazione di BKPyV, è stato testato per la sua inibizione dell'espressione genica precoce virale. A tal fine, un saggio a doppia fluorescenza-reporter è stato utilizzato come pubblicato in precedenza5. Lo schema di flusso di lavoro complessivo dell'installazione .......
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Discussione
In questo articolo viene presentato un metodo comunemente usato che consente l'analisi dell'attività BKPyV di controllo non codificante (NCCR) guidata in anticipo e in ritardo. L'attività NCCR può essere misurata simultaneamente e non necessita di lisi delle cellule trafette. Inoltre, è possibile analizzare un numero relativamente elevato di cellule e non è necessaria la co-trasfezione di marcatori aggiuntivi per la normalizzazione dei valori di fluorescenza.
Una parte fondamentale di questo m.......
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Dichiarazioni
Johannes Korth ha ricevuto sovvenzioni per le spese di oratore e viaggidano da Astellas e Novartis. Marek Widera ha ricevuto commissioni di consulenza da Novartis. Oliver Witzke ha ricevuto sovvenzioni per studi clinici, spese per gli oratori, onorarie e spese di viaggio da Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. K'hler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi e TEVA.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Barbara Bleekmann per l'eccellente assistenza tecnica. Questi studi sono stati sostenuti dal programma IFORES della Scuola Medica dell'Università di Duisburg-Essen e dal programma RIMUR dell'Alleanza dell'Alleanza universitaria Ruhr e Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Gli autori ringraziano il J'rgen-Manchot-Stiftung per la borsa di dottorato di Helene Sertznig e il supporto costante. La raccolta e l'uso del materiale per il paziente è stato approvato dal comitato etico della facoltà di medicina dell'Università Duisburg-Essen (14-6028-BO).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Scala da 100 bp | NEB | N3231 | Qualsiasi scala con una portata fino a 1 kb può essere sostituita Scala |
| 2 tronchi | NEB | N0550 | Qualsiasi scala con una portata fino a 10 kb può essere sostituita |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillina Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | può essere sostituito da qualsiasi produttore |
| BD FACSCanto&; II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma 10236276001 | ||
| DFC450C modulo fotocamera | Leica | Qualsiasi fotocamera può essere utilizzata | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | può essere sostituito da qualsiasi produttore |
| Microscopio LED DMIL | Leica | Qualsiasi microscopio a fluorescenza può essere utilizzato | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | può essere sostituito da qualsiasi produttore |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Qualsiasi FBS può essere utilizzato |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Qualsiasi software di citometria a flusso FBS può essere utilizzato | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Qualsiasi colorante di carico 6x può essere sostituito |
| HEK293T cellule | ATCC | 11268 | Queste cellule esprimono costitutivamente l'antigene T grande del virus delle scimmie 40 (SV40) e il clone 17 è stato selezionato specificamente per la sua elevata trasfettabilità. |
| L'incubatore a CO2 HERAcell® 240i | Thermo Scientific | può essere sostituito da qualsiasi produttore | |
| Kit PCR | HotStar Qiagen | 203203 | |
| Sistema di documentazione Intas Gel Intas | Qualsiasi sistema di visualizzazione per DNA colorato contenente gel di agarosio Può essere utilizzato | ||
| 850081 | Biozima | di agarosio a basso punto di fusione | può essere sostituito da qualsiasi produttore |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | può essere sostituito da qualsiasi produttore |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmide che ospita il genoma a lunghezza intera del ceppo BKPyV Dunlop; è stato utilizzato come controllo positivo; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | prodotto fuori produzione | Qualsiasi termociclatore può essere utilizzato |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | può essere sostituito da qualsiasi produttore |
| PCR1 e PCR2 Primers | metabion | non applicabile | Dissalato. Diluire a (10 µ M) con acqua di grado PCR |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | può essere sostituito da qualsiasi produttore |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | Un colorante a base di fluorescenza per la misurazione della concentrazione di dsDNA |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligasi | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Tripsina 0,05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | può essere sostituito da qualsiasi produttore |
| Kit plasmidico ZymoPURE II | Zymo | D4201 | può essere sostituito da qualsiasi produttore |
Riferimenti
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al.
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Ristampe e permessi
