Brug af Alu Element, der indeholder Minigenes til at analysere cirkulære RNA'er
Summary
Vi klon og analysere reporter gener genererer cirkulære RNAs. Disse reporter gener er større end konstruktioner til at analysere lineær splejsning og indeholder Alu elementer. For at undersøge de cirkulære RNA’er transkaperer konstruktionerne til celler, og det resulterende RNA analyseres ved hjælp af RT-PCR efter fjernelse af lineært RNA.
Abstract
Ud over lineære mRNAs, mange eukaryote gener generere cirkulære RNA’er. De fleste cirkulære RNA’er genereres ved at tilslutte sig et 5′ splejsningssted med et opstrøms 3′ splejsningssted inden for et præ-mRNA, en proces kaldet back-splejsning. Denne cirkularisering er sandsynligvis hjulpet af sekundære strukturer i præ-mRNA, der bringer splejsning steder i umiddelbar nærhed. I menneskelige gener, Alu elementer menes at fremme disse sekundære RNA strukturer, som Alu elementer er rigelige og udviser base komplementariteter med hinanden, når de er til stede i modsatte retninger i præ-mRNA. Her beskriver vi generering og analyse af store, Alu element, der indeholder reporter gener, der danner cirkulære RNA’er. Gennem optimering af kloningsprotokoller kan der genereres reportergener med en skærlængde på op til 20 kb. Deres analyse i samtransfection eksperimenter gør det muligt at identificere lovgivningsmæssige faktorer. Således kan denne metode identificere RNA-sekvenser og cellulære komponenter involveret i cirkulær RNA-dannelse.
Introduction
Cirkulære RNA’er
Cirkulære RNA’er (circRNAs) er kovalent lukkede enkeltstrandede RNA’er, der er udtrykt i de fleste organismer. De genereres ved at slutte sig til et nedstrøms 5’splice site til en opstrøms 3’splice site, en proces kaldet back-splejsning (Figur 1A)1. Sekvenser i præ-mRNA, der udviser base komplementære så kort som 30-40 nt bringe back-splejsning steder i korrekt tilpasning til circRNA dannelse2. Hos mennesker danner Alu-grund1 , der repræsenterer ca. 11 % af genomet3, omfattende dobbeltstrengede RNA-strukturer i præ-mRNA på grund af deres selvkomplementaritet4,5 og fremmer dermed dannelsen af circRNAs1.
I øjeblikket er tre vigtige funktioner i circRNAs blevet beskrevet. Nogle circRNAs binder microRNAs (miRNAs) og gennem binding fungerer som miRNA svampe6. CircRNAs har været involveret i transskriptionel og post transskriptionel regulering, gennem konkurrence med lineær splejsning7 eller graduering af transskription faktor aktivitet8. Endelig indeholder circRNAs korte åbne læserammer og principbevissundersøgelser, at de kan oversættes9,10. Men funktionen af de fleste circRNAs forbliver gådefuld. Størstedelen af de cirkulære RNA’er er blevet opdaget ved hjælp af næste generations sekventeringsmetoder11. Detaljerede analyser af individuelle gener ved hjælp af målrettede RT-PCR-tilgange viser , at der stadig er et stort antal cirkulære rna’er , der mangler at blive opdaget12.
Brug af reporter gener til at analysere pre-mRNA behandling
Analysen af mRNA stammer fra DNA reporter konstruktioner transfected i celler er en veletableret metode til at studere alternative pre-mRNA splejsning, som kan anvendes på cirkulære RNA’er. Generelt forstærkes den alternative ekson, dens omgivende introner og konstituerende eksoner og klonerer til en eukaryote ekspressionsvektor. Ofte er intronerne forkortet. Konstruktionerne transktres i eukaryote celler og analyseres normalt af RT-PCR13,14. Denne fremgangsmåde er i vid udstrækning blevet anvendt til at kortlægge reguleringssplejsningsanlæg og trans-acting faktorer i samtransfection eksperimenter13,15,16,17,18. Desuden gav generering af proteineksyderier mulighed for screening af stoffer, der ændrer alternativ splejsning19,20.
Metoden er blevet anvendt på cirkulære RNA’er. I øjeblikket er mindst 12 minigene backbones blevet beskrevet i litteraturen og er sammenfattet i tabel 1. Med undtagelse af tRNA-baserede ekspressionssystem21,22, er de alle afhængige af polymerase II-promotorer. Her beskriver vi en metode til at generere menneskelige reporter minigenes at bestemme cis og trans-handler faktorer, der er involveret i dannelsen af cirkulære RNA’er. En oversigt over metoden ved hjælp af sekvenser af et offentliggjort reporter-gen23 er vist i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generelt cirkulære RNA’er er lav rigelige1, hvilket komplicerer studiet af deres funktion og dannelse. I lighed med lineære RNA’er13gør brugen af reporterminigenes det muligt at identificere cis og transvirkende faktorer, der regulerer dannelsen af cirkulære rna’er. Således genererer denne tilgang hypoteser, der kan testes yderligere ved hjælp af de endogene gener.
Det mest kritiske skridt er udformningen af reporter genet. Den enzymatiske …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Department of Defense DoD tilskud AZ180075. Stefan Stamm tak Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin blev støttet af DAAD, tysk akademisk udvekslingsprogram, Justin R. Welden var en modtager af University of Kentucky Max Steckler Award.
Materials
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
| Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
| Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
| Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
| Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
| Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
| RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
| Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
| Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
Riferimenti
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
- Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
- Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
- Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
- Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
- Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
- Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
- Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
- Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
- Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
- Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
- Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
- Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
- Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
- Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
- Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
- Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
- Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
- Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
- Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
- Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
- Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
- Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
- Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
- Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
- Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
- Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
- Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
- Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
- Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
- Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
- Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
- Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).
