Utilisation d’un élément Alu contenant des minigènes pour analyser les ARN circulaires
Summary
Nous cloner et analyser les gènes des reporters générant des ARN circulaires. Ces gènes reporter sont plus grands que les constructions pour analyser l’épissage linéaire et contenir des éléments Alu. Pour étudier les ARN circulaires, les constructions sont transfected dans les cellules et l’ARN résultant est analysé à l’aide de RT-PCR après l’élimination de l’ARN linéaire.
Abstract
En plus des ARM linéaires, de nombreux gènes eucaryotes génèrent des ARN circulaires. La plupart des ARN circulaires sont générés en rejoignant un site d’épissage 5′ avec un site d’épissage en amont 3′ dans un pré-mRNA, un processus appelé back-splicing. Cette circularisation est probablement facilitée par des structures secondaires dans le pré-mRNA qui amènent les sites d’épissage à proximité. Dans les gènes humains, les éléments Alu sont pensés pour promouvoir ces structures secondaires d’ARN, car les éléments d’Alu sont abondants et présentent des complémentarités de base les unes avec les autres lorsqu’ils sont présents dans des directions opposées dans l’ARN pré-m. Ici, nous décrivons la génération et l’analyse de grand élément Alu contenant des gènes de reporter qui forment des ARN circulaires. Grâce à l’optimisation des protocoles de clonage, des gènes reporter avec jusqu’à 20 kb de longueur d’insertion peuvent être générés. Leur analyse dans les expériences de co-transfection permet d’identifier les facteurs réglementaires. Ainsi, cette méthode peut identifier les séquences d’ARN et les composants cellulaires impliqués dans la formation circulaire d’ARN.
Introduction
Arn circulaires
Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN échoués isolés fermés covalentement qui sont exprimés dans la plupart des organismes. Ils sont générés en rejoignant un site d’épissage en aval 5′ à un site d’épissage en amont 3′, un processus appelé back-splicing (Figure 1A)1. Les séquences de l’ARNM pré-mRNA qui présentent une base complémentaire aussi courte que 30-40 nt apportent des sites d’attelle arrière dans un alignement approprié pour la formation d’ARN2. Chez l’homme, les éléments Alu 1, représentant environ 11% du génome3, forment de vastes structures d’ARN double brin dans l’ARN pré-mRNA en raison de leur auto-complémentarité4,5 et favorisent ainsi la formation de circRNAs1.
À l’heure actuelle, trois fonctions principales des circARN ont été décrites. Certains circRNAs lient microARN (miRNAs) et par la séquestration agissent comme des éponges miRNA6. Les CircRNAs ont été impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle, par la concurrence avec l’épissage linéaire7 ou la modulation de l’activité du facteur de transcription8. Enfin, les circARN contiennent de courts cadres de lecture ouverts et des études de preuve de principe montrent qu’ils peuvent être traduits9,10. Cependant, la fonction de la plupart des circRNAs reste énigmatique. La majorité des ARN circulaires ont été détectés à l’aide de méthodes de séquençage de nouvelle génération11. Des analyses détaillées des gènes individuels à l’aide d’approches ciblées RT-PCR révèlent qu’un grand nombre d’ARN circulaires reste à découvrir12.
Utilisation de gènes reporter pour analyser le traitement pré-mRNA
L’analyse de l’ARNm dérivée des constructions de reporter d’ADN transfected dans des cellules est une méthode bien établie pour étudier l’épissage alternatif d’ARNm, qui peut être appliqué aux ARN circulaires. En général, l’exon alternatif, ses introns environnants, et les exons constitutifs sont amplifiés et clonés dans un vecteur d’expression eucaryote. Fréquemment, les introns sont raccourcis. Les constructions sont transfected dans des cellules eucaryotes et généralement analysés par RT-PCR13,14. Cette approche a été largement utilisée pour cartographier les sites d’épissage réglementaire et les facteurs trans-acteurs dans les expériences de co-transfection13,15,16,17,18. En outre, la génération de minigènes exprimant des protéines a permis le dépistage des substances qui changent l’épissage alternatif19,20.
La méthode a été appliquée aux ARN circulaires. À l’heure actuelle, au moins 12 épines dorsales minigène ont été décrites dans la littérature et sont résumées dans le tableau 1. À l’exception du système d’expression basé sur l’ARN TRNA21,22, ils sont tous dépendants des promoteurs de polymérase II. Ici, nous décrivons une méthode pour générer des minigènes de reporter humain pour déterminer les cis et les facteurs trans-agissant impliqués dans la génération des ARN circulaires. Un aperçu de la méthode à l’aide de séquences d’un gène reporter publié23 est montré dans la figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
En général, les ARN circulaires sont faibles abondants1, ce qui complique l’étude de leur fonction et de leur formation. Semblable aux ARN linéaires13, l’utilisation de minigènes reporter permet l’identification des cis et des facteurs trans-acteurs qui régulent la formation d’ARN circulaires. Ainsi, cette approche génère des hypothèses qui peuvent être testées plus en utilisant les gènes endogènes.
L’étape la plus critiqu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense DoD subvention AZ180075. Stefan Stamm remercie Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin a été soutenue par le DAAD, programme allemand d’échange académique, Justin R. Welden a été récipiendaire de l’Université du Kentucky Max Steckler Award.
Materials
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
| Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
| Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
| Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
| Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
| Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
| RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
| Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
| Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
Riferimenti
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Deininger, P. Alu elements: know the SINEs. Genome Biology. 12 (12), 236 (2011).
- Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. Genome-wide analysis of Alu editability. Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).
- Levanon, E. Y., et al. Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome. Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization. Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Yang, Y., et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine. Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).
- Abe, N., et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells. Scientific Reports. 5, 16435 (2015).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLOS Genetics. 9 (9), 1003777 (2013).
- Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs. Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).
- Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene. Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).
- Gaildrat, P., et al. Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants. Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Baralle, D., Baralle, M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes. Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).
- Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR. Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).
- Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).
- Shen, M., et al. Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).
- Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing. RNA Biology. , 1-7 (2017).
- Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing. Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).
- Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. The human MAPT locus generates circular RNAs. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).
- Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).
- Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wang, Y., et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (3), 1197-1207 (2004).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
- Jeck, W. R., Sharpless, N. E. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology. 32 (5), 453-461 (2014).
- Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
- Kramer, M. C., et al. Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes & Development. 29 (20), 2168-2182 (2015).
- Starke, S., et al. Exon circularization requires canonical splice signals. Cell Reports. 10 (1), 103-111 (2015).
- Suzuki, H., Tsukahara, T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).
- Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
- Liang, D., Wilusz, J. E. Short intronic repeat sequences facilitate circular RNA production. Genes & Development. 28 (20), 2233-2247 (2014).
- Wang, Y., Mandelkow, E. Tau in physiology and pathology. Nature Reviews Neuroscience. 17 (1), 5-21 (2016).
- Fejes-Toth, K., et al. Post-transcriptional processing generates a diversity of 5′-modified long and short RNAs. Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).
- Gao, Q. S., et al. Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia. Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).
- Hartmann, A. M., et al. Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors. Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).
- Wang, Y., Wang, Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs. RNA. 21 (2), 172-179 (2015).
- Yang, Y., Wang, Z. Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA. Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).
- Zheng, Q., et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications. 7, 11215 (2016).
- Jia, W., Xu, B., Wu, J. Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells. Metabolism. 85, 192-204 (2018).
- Liang, D., et al. The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).
- Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
- Li, X., et al. Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).
- Zhang, Y., et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).
