Doppia bioluminescenza Imaging della progressione tumorale e dell'angiogenesi
Summary
Questo protocollo descrive l’istituzione di un modello murino portatore di tumori per monitorare la progressione del tumore e l’angiogenesi in tempo reale mediante la doppia bioluminescenza.
Abstract
L’angiogenesi, come un processo cruciale di progressione del tumore, è diventata un hotspot di ricerca e bersaglio della terapia anti-tumorale. Tuttavia, non esiste un modello affidabile per tracciare la progressione del tumore e l’angiogenesi contemporaneamente in modo visivo e sensibile. L’imaging a bioluminescenza mostra la sua superiorità unica nell’imaging vivente grazie ai suoi vantaggi di alta sensibilità, forte specificità e misurazione accurata. Presentato qui è un protocollo per stabilire un modello di topo portatore di tumore iniettando una linea cellulare 4T1 con la luciferae del morina con etichetta a Renilla nel topo transgenico con espressione di luciferasi Firefly indotta dall’angiogenesi. Questo modello di topo fornisce uno strumento prezioso per monitorare simultaneamente la progressione del tumore e l’angiogenesi in tempo reale mediante l’imaging a doppia bioluminescenza in un singolo topo. Questo modello può essere ampiamente applicato nello screening farmacoanti e nella ricerca oncologica.
Introduction
L’angiogenesi è un processo essenziale nella progressione del cancro da neoplasmi piccoli e localizzati a tumori più grandi e potenzialmente metastatici1,2. La correlazione tra la crescita del tumore e l’angiogenesi diventa uno dei punti di enfasi nel campo della ricerca oncologica. Tuttavia, i metodi tradizionali di misurazione dei cambiamenti morfologici non riescono a monitorare contemporaneamente la progressione del tumore e l’angiogenesi negli animali viventi utilizzando un approccio visualizzato.
L’imaging di bioluminescenza (BLI) delle cellule tumorali è un metodo sperimentale particolarmente appropriato per monitorare la crescita del tumore a causa della sua non invasiva, sensibilità e specificità3,4,5,6 . La tecnologia BLI si basa sul principio che la luciferasi può catalizzare l’ossidazione di un substrato specifico emettendo bioluminescenza. Le luciferasi espresse nelle cellule tumorali impiantate reagiscono con il substrato iniettato, che può essere rilevato da un sistema di imaging vivente, e i segnali riflettono indirettamente i cambiamenti nel numero di cellule o nella localizzazione cellulare in vivo6,7.
Fatta eccezione per la crescita del tumore, l’angiogenesi tumorale (il passo critico nella progressione del cancro) può essere visualizzata anche attraverso la tecnologia BLI utilizzando topi transgenici Vegfr2-Fluc-KI8,9,10. Il fattore di crescita endoteliale vascolare (Vegf) recettore 2 (Vegfr2), un tipo di recettore Vegf, è per lo più espresso nelle cellule endoteliali vascolari dei topi adulti11. Nei topi transgenici Vegfr2-Fluc-KI, la sequenza di DNA della luciferasi di lucciola (Fluc) viene gettata nel primo esone della sequenza endogena di Vegfr2. Di conseguenza, il Fluc è espresso (che appare come segnali BLI) in un modo che è identico al livello di angiogenesi nei topi. Per crescere oltre pochi millimetri di dimensioni, il tumore recluta nuove vascoli dal vaso sanguigno esistente, che esprimono altamente il Vegfr2 innescato da fattori di crescita dalle cellule tumorali1. Questo apre la possibilità di utilizzare topi transgenici Vegfr2-Fluc-KI per monitorare non invasiva l’angiogenesi tumorale di BLI.
In questo protocollo, viene stabilito un modello murino portatore di tumore per monitorare la progressione del tumore e l’angiogenesi in un singolo topo attraverso Firefly luciferate (Fluc) e Renilla luciferate (Rluc) imaging, rispettivamente (Figura 1). Viene creata una linea cellulare 4T1 (4T1-RR) che esprime stabilmente Rluc e proteina fluorescente rossa (RFP) per tracciare la crescita cellulare mediante Rluc imaging. Per studiare ulteriormente i cambiamenti dinamici dell’angiogenesi nella progressione e nella regressione del tumore, viene creata un’altra linea cellulare 4T1 (4T1-RRT) che esprime il gene suicida dell’herpes simplex virus troncato la tiofina (HSV-ttk), Rluc e RFP. Con la somministrazione del ganciclovir (GCV), le cellule che esprimono HSV-ttk sono selettivamente ablate. Sulla base di queste linee cellulari, viene costruito un modello portante del tumore nei topi Vegfr2-Fluc-KI che funge da modello sperimentale che rileva la progressione del tumore e l’angiogenesi tumorale in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, viene descritto un approccio duale BLI non invasivo per il monitoraggio dello sviluppo del tumore e dell’angiogenesi. Il sistema di reporter BLI viene inizialmente sviluppato, contenente il gene suicida HSV-ttk/GCV per monitorare la progressione del tumore e la regressione in vivo da parte dell’imaging Rluc. Nel frattempo, l’angiogenesi tumorale viene valutata utilizzando topi Vegfr2-Fluc-KI tramite l’imaging Fluc. Questo modello murino portante è in grado di fornire una piattaforma pratica per lo …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Key R&D Program of China (2017YFA0103200), dalla National Natural Science Foundation of China (81671734) e dai progetti chiave del programma di sostegno alla scienza e la tecnologia di Tianjin (18YF università centrali (63191155). Riconosciamo le revisioni di Gloria Nance, che sono state preziose per migliorare la qualità del nostro manoscritto.
Materials
| 0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 1.5 mL Tubes | Axygen Scientific | MCT-105-C-S | |
| 15 mL Tubes | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| 60 mm Dish | Corning Glass Works | 430166 | |
| 6-well Plate | Corning Glass Works | 3516 | |
| Biosafety Cabinet | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidine S Hydrochloride (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Cell Counting Kit-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Tegulated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Coelenterazine (CTZ) | NanoLight Technology | 479474 | |
| D-luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 119222 | |
| DMEM Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich | Y0001129 | |
| Graphics Software | GraphPad Software | Graphpad Prism 6 | |
| Insulin Syringe Needles | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurane | Baxter | 691477H | |
| Lentiviral Packaging System | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | |
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | Living Imaging Software 4.2 | |
| Living Imaging System | Caliper Life Sciences | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Glass Works | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Ultra-low Temperature Refrigerator | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | XENOGEN Corporation | 7293 |
Riferimenti
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