Questo protocollo descrive l'istituzione di un modello murino portatore di tumori per monitorare la progressione del tumore e l'angiogenesi in tempo reale mediante la doppia bioluminescenza.
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Articolo metodologico
Doppia bioluminescenza Imaging della progressione tumorale e dell'angiogenesi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'angiogenesi, come un processo cruciale di progressione del tumore, è diventata un hotspot di ricerca e bersaglio della terapia anti-tumorale. Tuttavia, non esiste un modello affidabile per tracciare la progressione del tumore e l'angiogenesi contemporaneamente in modo visivo e sensibile. L'imaging a bioluminescenza mostra la sua superiorità unica nell'imaging vivente grazie ai suoi vantaggi di alta sensibilità, forte specificità e misurazione accurata. Presentato qui è un protocollo per stabilire un modello di topo portatore di tumore iniettando una linea cellulare 4T1 con la luciferae del morina con etichetta a Renilla nel topo transgenico con espressione di luciferasi Firefly indotta dall'angiogenesi. Questo modello di topo fornisce uno strumento prezioso per monitorare simultaneamente la progressione del tumore e l'angiogenesi in tempo reale mediante l'imaging a doppia bioluminescenza in un singolo topo. Questo modello può essere ampiamente applicato nello screening farmacoanti e nella ricerca oncologica.
Introduzione
L'angiogenesi è un processo essenziale nella progressione del cancro da neoplasmi piccoli e localizzati a tumori più grandi e potenzialmente metastatici1,2. La correlazione tra la crescita del tumore e l'angiogenesi diventa uno dei punti di enfasi nel campo della ricerca oncologica. Tuttavia, i metodi tradizionali di misurazione dei cambiamenti morfologici non riescono a monitorare contemporaneamente la progressione del tumore e l'angiogenesi negli animali viventi utilizzando un approccio visualizzato.
L'imaging di bioluminescenza (BLI) delle cellule tumorali è un metodo sperimentale particolarmente appropriato per monitorare la crescita del tumore a causa della sua non invasiva, sensibilità e specificità3,4,5,6 . La tecnologia BLI si basa sul principio che la luciferasi può catalizzare l'ossidazione di un substrato specifico emettendo bioluminescenza. Le luciferasi espresse nelle cellule tumorali impiantate reagiscono con il substrato iniettato, che può essere rilevato da un sistema di imaging vivente, e i segnali riflettono indirettamente i cambiamenti nel numero di cellule o nella localizzazione cellulare in vivo6,7.
Fatta eccezione per la crescita del tumore, l'angiogenesi tumorale (il passo critico nella progressione del cancro) può essere visualizzata anche attraverso la tecnologia BLI utilizzando topi transgenici Vegfr2-Fluc-KI8,9,10. Il fattore di crescita endoteliale vascolare (Vegf) recettore 2 (Vegfr2), un tipo di recettore Vegf, è per lo più espresso nelle cellule endoteliali vascolari dei topi adulti11. Nei topi transgenici Vegfr2-Fluc-KI, la sequenza di DNA della luciferasi di lucciola (Fluc) viene gettata nel primo esone della sequenza endogena di Vegfr2. Di conseguenza, il Fluc è espresso (che appare come segnali BLI) in un modo che è identico al livello di angiogenesi nei topi. Per crescere oltre pochi millimetri di dimensioni, il tumore recluta nuove vascoli dal vaso sanguigno esistente, che esprimono altamente il Vegfr2 innescato da fattori di crescita dalle cellule tumorali1. Questo apre la possibilità di utilizzare topi transgenici Vegfr2-Fluc-KI per monitorare non invasiva l'angiogenesi tumorale di BLI.
In questo protocollo, viene stabilito un modello murino portatore di tumore per monitorare la progressione del tumore e l'angiogenesi in un singolo topo attraverso Firefly luciferate (Fluc) e Renilla luciferate (Rluc) imaging, rispettivamente (Figura 1). Viene creata una linea cellulare 4T1 (4T1-RR) che esprime stabilmente Rluc e proteina fluorescente rossa (RFP) per tracciare la crescita cellulare mediante Rluc imaging. Per studiare ulteriormente i cambiamenti dinamici dell'angiogenesi nella progressione e nella regressione del tumore, viene creata un'altra linea cellulare 4T1 (4T1-RRT) che esprime il gene suicida dell'herpes simplex virus troncato la tiofina (HSV-ttk), Rluc e RFP. Con la somministrazione del ganciclovir (GCV), le cellule che esprimono HSV-ttk sono selettivamente ablate. Sulla base di queste linee cellulari, viene costruito un modello portante del tumore nei topi Vegfr2-Fluc-KI che funge da modello sperimentale che rileva la progressione del tumore e l'angiogenesi tumorale in vivo.
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Protocollo
Gli esperimenti devono essere conformi alle normative nazionali e istituzionali relative all'uso degli animali a fini di ricerca. Devono essere ottenuti i permessi per effettuare esperimenti. Il trattamento degli animali e le procedure sperimentali dello studio aderiscono alle linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Nankai che sono conformi alle Linee guida per la cura degli animali approvate dai National Institutes of Health (NIH).
1. Imballaggio e produzione lentivirale LV-Rluc-RFP (RR) e LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT)
NOTA: Il pLV-RR trasporta le sequenze genetiche di Renilla luciferase (Rluc) e proteina fluorescente rossa (RFP) sotto il promotore EF1, mentre il pLV-RRT trasporta le sequenze geniche codificando Rluc, RFP, e herpes simplex troncare la chinasi tiofina virus (HSV-ttk) ( figura 2).
- Seme 1 x 106 di 293T cellule per bene in una piastra e coltura 6 pozzetti durante la notte in un'incubatrice umidificata con 5% di CO2 a 37 gradi centigradi con il mezzo aquila modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS).
- Preparare la sospensione lipososo: mescolare 7,5 litri di liposoma e 0,25 mL di mezzo essenziale minimo (MEM) in un tubo da 1,5 mL dopo l'incubazione per 5 min a temperatura ambiente (RT) per disperdere equamente i liposomi.
- Preparare la soluzione DNA (DNAs-RR): separatamente, aggiungere il vettore pLV-RR e il plasmidi helper a 0,25 mL di MEM in un tubo da 1,5 mL, come descritto nella tabella 1.
- Ottenere il composto liposoma/DNA-RR: aggiungere delicatamente la soluzione DNAs-RR in una sospensione liposoma preparata a goccia e incubare per 20 minuti a RT in modo che il DNA si lega alla membrana lipidica.
- Sostituire il mezzo delle celle 293T con 1 mL di DMEM contenente 10% FBS e aggiungere delicatamente il composto liposoma/DNA-RR al mezzo delle celle 293T.
- Dopo aver incubato in un'incubatrice umidificata con il 5% di CO2 a 37 gradi centigradi per 12-16 h, sostituire il composto liposoma/DNA-RR contenente un mezzo delle celle 293T con 1 mL di DMEM contenente il 10% di FBS e 100 ml di penicillina-streptomica.
- Continuare a coltivare le cellule 293T nell'incubatrice umidificata per 48 h dopo la trasfezione. Quindi, raccogliere il supernatante delle cellule 293T e centrificare il mezzo a 300 x g per 5 min per pellet le cellule 293T. Trasferire il supernabile contenente lentivirus-RR (LV-RR) in tubi di stoccaggio in polipropilene sterile da 1,5 ml e conservarlo a -80 gradi centigradi.
NOTA: per lavorare con lentivirus ricombinante è necessario un impianto di biosicurezza di livello 2 (BSL-2). - Ripetere i passaggi da 1.1–1.7 e utilizzare il vettore pLV-RRT al posto del vettore pLV-RR nel passaggio 1.3 per ottenere il lentivirus-RRT (LV-RRT). Conservare l'LV-RRT a -80 gradi centigradi.
NOTA: Lo stock di lentivirale non purificato può inibire la crescita cellulare in alcuni casi. Potrebbe essere necessario purifiare lo stock di lentivirale. Gli stock lentivirali contenenti particelle LV-RR o LV-RRT devono essere suddivisi in tubi da 1,5 mL (1 mL per tubo) per lo stoccaggio per evitare più cicli di sgelo libero.
2. Trasduzione lentivirale LV-RR e LV-RRT per l'espressione genica nelle cellule 4T1
- Semina 4T1 cellule in una piastra di 6 pozzetti (5 x 105 cellule / bene) e la coltura con Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media contenente 10% FBS durante la notte in un'incubatrice umidizzata con 5% CO2 a 37 .
- Togliere il mezzo dalla piastra di coltura e sostituirlo con 1 mL di RPMI 1640 medio fresco e 1 mL di brodo lentivirale (LV-RR o LV-RRT) per ogni pozzo. Aggiungere 8 g/mL di polibrene e frullare delicatamente il mezzo contenente particelle lentivirali pipeting su e giù.
NOTA: Si prega di essere consapevoli del fatto che il mezzo contiene particelle lentivirali, che potrebbero tradurre le cellule umane. - Soluzione di trasduzione dello spin in una centrifuga a 1.000 g per 60 min a RT per contribuire ad aumentare l'efficienza della trasduzione. Dopo la centrifugazione, coltura 4T1 cellule per 4-12 h e mantenere in un incubatore umidificato con 5% CO2 a 37 .
NOTA: Per alcune linee cellulari, la polibrena può essere tossica per la coltura a lungo termine. Pertanto, il tempo di incubazione per trasdurre cellule diverse può essere modificabile. Controllare lo stato della cella più volte per trovare il tempo di incubazione appropriato. - Aggiornare il mezzo di cellule 4T1 trasdotte con 2 mL di RPMI 1640 medio contenente 10% FBS e 100 U/mL penicillina-streptomicina per rimuovere particelle lentivirali e polibrene.
3. Screening farmacologico e identificazione delle cellule LV-RR e LV-RRT trasdotte 4T1
- Selezionare le cellule trasdotte con mezzo contenente blasticidina (BSD) secondo il gene di resistenza BSD trasportato da LV-RR o LV-RRT come descritto nei seguenti passaggi.
NOTA: In alternativa, le cellule trasdotte che sono voSE-positive potrebbero essere selezionate dalla citometria di flusso in base al gene RFP trasportato da LV-RR o LV-RRT. - 48 h dopo la trasduzione, passaggio 4T1 cellule al rapporto di 1:3 a 1:4 con mezzo di selezione (RPMI 1640 medio contenente 10% FBS, 100 U /mL penicillina-streptomycin, e 5 g /mL BSD). Cambia media ogni 2 o 3 giorni.
NOTA: La concentrazione ottimale di BSD può variare da linea cellulare a linea cellulare. Pertanto, un esperimento pilota di curva di uccisione dovrebbe essere eseguito per determinare la concentrazione ottimale di BSD prima dell'esperimento iniziale. - 7 giorni dopo lo screening farmacologico, osservare le cellule 4T1 trasdotte l'LV-RR (4T1-RR) e le cellule lV-RRT traducite 4T1 (4T1-RRT) al microscopio a contrasto di fase invertito a fluorescenza. Contare il numero di celle RFPe 4T1 in tre campi visivi per stimare il rapporto RFP-positivo, rispettivamente (Figura 2).
NOTA: In alternativa, il rapporto RFP-positivo delle cellule 4T1 trasdotte potrebbe essere identificato dalla citometria di flusso. - Misurare i segnali di renilla delle cellule 4T1-RR e delle cellule 4T1-RRT utilizzando un sistema di imaging vivente per rilevare la relazione lineare tra i numeri delle cellule e i segnali di renilla (Figura 3).
- Espandere le celle 4T1-RR e 4T1-RRT schermate BSD con un mezzo di selezione a rapporti di divisione tra 1:3 e 1:4 e conservare le scorte di linee cellulari in azoto liquido.
4. Mouse Vegfr2-Fluc-KI e modello di topo portatore di tumori
NOTA: I topi trasgenici Vegfr2-Fluc-KI, di 6-8 settimane e femmine, vengono utilizzati in questo esperimento per monitorare in modo non invasivo l'angiogenesi in vivo da BLI.
- Coltura cellule 4T1-RR e 4T1-RRT cellule in 60 mm Petri piatti in un'incubatrice umidificata con 5% CO2 a 37 gradi centigradi, rispettivamente. Quando le cellule sono confluenza dell'80%, rimuovere il mezzo e risciacquare con la salina tampone di fosfato (PBS).
- Rimuovere il PBS e aggiungere altri 2 mL di 0,25% trypsin-0.53 mM soluzione EDTA rispettivamente. Conservare il piatto a RT (o a 37 gradi centigradi) fino a quando le cellule non si stacchino.
- Aggiungere 5-10 mL di nuovo mezzo contenente 10% FBS, quindi aspirare e dispensare le cellule per rimettere in sospensione 4T1-RR e 4T1-RRT rispettivamente in tubi di centrifuga 15 mL. Contare due tipi di cellule 4T1 utilizzando una camera di conteggio e preparare le sospensioni cellulari ad una concentrazione di 1 x 106 per 100 L nel mezzo RPMI 1640.
- Anestesizzare i topi Vegfr2-Fluc-KI con 1%–3% di isoflurane in 100% di ossigeno nella camera di induzione per anestesia con una portata di 1 L/min. Monitorare la risposta del punta del topo per confermare lo stato di anestesia. Quindi, applicare unguento oftalmico agli occhi del topo per prevenire la disidratazione.
- Rimuovere il mouse dalla camera e la posizione in nosecone. Rimuovere completamente i capelli della spalla del mouse utilizzando rasoio elettrico e crema per la rimozione dei peli, che potrebbe fornire una buona vista del campo chirurgico ed evitare di bloccare i segnali BLI negli esperimenti di follow-up.
- Iniettare sottocutaneamente cellule 4T1-RR (1 x 106 celle a un volume totale di 100 l) e 4T1-celle RRT (1 x 106 celle con un volume totale di 100 l) rispettivamente sulle spalle sinistra e destra di ciascun topo (registra come Giorno 0). Posizionare i topi nell'area di recupero con supporto termico fino al recupero completo.
- Dopo l'impianto di cellule 4T1-RR e 4T1-RRT, toccare le masse tumorali per verificare che i topi siano tumorali ogni giorno (Figura S1). Al giorno 7 dopo l'impianto, iniettare intraperitonealmente 50 mg/kg ganciclovir (GCV) ai topi tumorali due volte al giorno fino alla fine dell'esperimento.
NOTA: Prima di questo esperimento, deve essere rilevato il citotossico di GCV su cellule 4T1-RRT. L'efficienza di uccisione del GCV potrebbe essere valutata mediante analisi del conteggio cellulare con diversa concentrazione di GCV (FiguraS2). - Il giorno 0, 3, 7, 14 e 21 dopo l'impianto 4T1, monitorare la crescita del tumore e l'angiogenesi dei topi portatori di tumore e valutare sia da Rluc che da Fluc imaging (Figura 4).
5. Doppia bioluminescenza imaging del tumore (Rluc) e dell'angiogenesi (Fluc)
- Aprire il sistema di imaging vivente, inizializzare il software di imaging vivente e quindi inizializzare il sistema.
NOTA: l'inizializzazione del sistema richiederà alcuni minuti per raffreddare la fotocamera del dispositivo accoppiato con carica (CCD) a -90 gradi centigradi prima di poter avviare l'imaging. La temperatura diventa verde quando la fotocamera CCD viene raffreddata. - Utilizzare le seguenti impostazioni della fotocamera:
Controllare la Luminescenza e la Fotografia.
Selezionare Sovrapposizione.
Impostazioni di luminescenza:
Il tempo di esposizione imposta AUTO in condizioni normali.
Binning imposta a 8.
F/Stop imposta su 1.
Filtro di emissione imposta Aperto.
Impostazioni foto:
Binning imposta su medio.
F/Stop imposta su 8.
Impostazioni di sistema IVIS:
Campo visivo: vista del mouse c'è 1, vista mouse D-5.
L'altezza del soggetto imposta 1,5 cm. - Pesare e registrare i topi e calcolare il volume di coelenterazina (Tza; 2,5 mg/kg) e D-lucidferina (150 mg/kg) necessari.
- Anestesizzare il topo portatore di tumore dell'1%-3% dell'isoflurane in ossigeno al 100% presso la camera di induzione per anestesia con una portata di 1 L/min. Monitorare la risposta del punta del topo per confermare lo stato di anestesia. Quindi, erogare una goccia di unguento oculare lubrificante su entrambi gli occhi per evitare danni alla cornea.
- Iniettare nella retrobulbar del topo (ad esempio, per un topo da 20 g, iniettare 15 L per fornire 50 g di TT) utilizzando un ago di siringa insulina.
- Spostare il mouse portante del tumore nella camera della fotocamera con il naso nell'anestesia cone delicatamente e acquisire diverse immagini del mouse dorsale immediatamente per ottenere i segnali Rluc da 4T1 cellule fino a quando i segnali BLI svaniscono.
NOTA: L'emivita di PT è molto breve e i segnali di Rluc cadono precipitosamente 30 dollari. Per garantire che qualsiasi segnale Rluc residuo si sia dissipato e l'intervallo tra Rluc e L'imaging Fluc dovrebbe essere superiore a 10 min. - Intraperitonealmente iniettare 150 mg/kg D-lucidferina (30 mg/mL) utilizzando un ago di siringa di insulina (ad esempio, per un topo da 20 g, iniettare 100 l per fornire 3 mg di D-luciferin). Tenere il mouse a RT per 10 min prima dell'imaging Fluc.
- Spostare questo mouse nella camera della fotocamera con il naso nel cono di anestesia di nuovo e acquisire diverse immagini del topo dorsale per ottenere i segnali Fluc dall'angiogenesi.
NOTA: Il monitor cinetico Fluc deve essere eseguito per ogni mouse fino a quando i segnali raggiungono il massimo e poi svaniscono. - Ripetere le procedure passaggi da 5,4 a 5,8 per ogni mouse.
- Dopo l'imaging, mantenere i topi in un ambiente caldo fino a quando gli animali si svegliano.
- Nel punto desiderato (giorno 3, 7, 14 e 21), ripetere le procedure di cui sopra (passaggio 5.3–5.10) per rilevare la progressione del tumore e l'angiogenesi tumorale nel tempo.
- Analizzare i dati dei segnali Rluc e Fluc per studiare la relazione tra la crescita del tumore e l'angiogenesi nella progressione del tumore.
NOTA: Le regioni di interesse (ROI) che coprono il sito del segnale BLI vengono utilizzate per analizzare i dati. Misurare la radianza totale (fotoni) del ROI nell'unità di Foton/secondi/cm2/steradian (p/s/cm2/sr) per ogni timepoint. - Analizzare i segnali Rluc e Fluc del ROI utilizzando il software grafico (Figura 4).
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Risultati
In questo esperimento, è stato stabilito un modello di topo del cancro al seno utilizzando cellule 4T1 per studiare la relazione tra la crescita tumorale e l'angiogenesi tumorale (Figura 1). In primo luogo, sono stati confezionati due lentivirus, che portavano sequenze geniche che esprimevano rispettivamente Rluc/RFP (LV-RR) e Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT), come precedentemente riportato7. Quindi, due diverse linee cellulari 4T1, denominat...
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Discussione
In questo protocollo, viene descritto un approccio duale BLI non invasivo per il monitoraggio dello sviluppo del tumore e dell'angiogenesi. Il sistema di reporter BLI viene inizialmente sviluppato, contenente il gene suicida HSV-ttk/GCV per monitorare la progressione del tumore e la regressione in vivo da parte dell'imaging Rluc. Nel frattempo, l'angiogenesi tumorale viene valutata utilizzando topi Vegfr2-Fluc-KI tramite l'imaging Fluc. Questo modello murino portante è in grado di fornire una piattaforma pratica per lo s...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Key R&D Program of China (2017YFA0103200), dalla National Natural Science Foundation of China (81671734) e dai progetti chiave del programma di sostegno alla scienza e la tecnologia di Tianjin (18YF università centrali (63191155). Riconosciamo le revisioni di Gloria Nance, che sono state preziose per migliorare la qualità del nostro manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-0,53 mM EDTA | Gibco | 25200072 | |
| Provette da 1,5 mL | Axygen Scientific | MCT-105-C-S Provette | |
| 15 mL | Corning Glass Works | 601052-50 | |
| 293T | ATCC | CRL-3216 | |
| 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| Piatto da 60 mm | Corning Glass Works | 430166 | |
| Piastra a 6 pozzetti | Corning Glass Works | 3516 | |
| Armadio di biosicurezza | Shanghai Lishen Scientific | Hfsafe-900LC | |
| Blasticidina S cloridrato (BSD) | Sigma-Aldrich | 15205 | |
| Kit di conteggio cellulare-8 | MedChem Express | HY-K0301 | |
| CO2 Incubatore regolato | Thermo Fisher Scientific | 4111 | |
| Celenterazina (CTZ) | Tecnologia NanoLight | 479474 | |
| D-luciferina Calibro a sale di potassio | Scienze della vita | 119222 | |
| DMEM | Medium Gibco | C11995500BT | |
| Siero fetale bovino (FBS) | BIOIND | 04-001-1A | |
| Microscopio a fluorescenza | Nikon | Ti-E/U/S | |
| Ganciclovir (GCV) | Sigma-Aldrich Y0001129 | ||
| Graphics Software | GraphPad Software Graphpad | Prism 6 | |
| Aghi per siringhe da insulina | Becton Dickinson | 328421 | |
| Isoflurano | Baxter | 691477H | |
| Sistema di confezionamento lentivirale | Biosettia | cDNA-pLV03 | |
| Liposoma | Invitrogen | ||
| Living Imaging Software | Calibro per le scienze della vita | per l'imaging vivente 4.2 | |
| Sistema di imaging vivente | Calibro per le scienze della vita | IVIS Lumina II | |
| MEM Medium | Invitrogen | 31985-070 | |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Corning Vetreria | R21031399 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268-1G | |
| RPMI1640 Medium | Gibco | C11875500BT | |
| SORVALL ST 16R Centrifuga | Thermo Fisher Scientific | Thermo Sorvall ST 16 ST16R | |
| Frigorifero a bassissima temperatura | Haier | DW-86L338 | |
| XGI-8 Sistema di anestesia a gas | XENOGEN Società | 7293 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
