Presentiamo un metodo utile per la sintesi e purificazione e depurazione esulla scala di specifici enantiomeri e regioisori di epossido di acido aracidonico (AA), acido docosaesaenoico (DHA) e acido eicosapentaeno (EPA) con l'uso di un citocromo batterico P450 enzima (BM3).
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Articolo metodologico
Sintesi ezimatica dei metaboliti epossidici degli acidi docosahexaenoici, eicosapentaenoici e aracidonici
In questo articolo
Sommario
Abstract
I metaboliti epossidizzati di vari acidi grassi polinsaturi (PUFA), rititi acidi grassi epossidici, hanno una vasta gamma di ruoli nella fisiologia umana. Questi metaboliti sono prodotti endogenamente dalla classe citocromatica P450 degli enzimi. A causa dei loro effetti biologici diversi e potenti, c'è un notevole interesse nello studio di questi metaboliti. Determinare i ruoli unici di questi metaboliti nel corpo è un compito difficile, in quanto gli acidi grassi epossidici devono prima essere ottenuti in quantità significative e con alta purezza. Ottenere composti da fonti naturali è spesso laborioso, e idrolasi epossido solubili (sEH) rapidamente idrolizzare i metaboliti. D'altra parte, ottenere questi metaboliti tramite reazioni chimiche è molto inefficiente, a causa della difficoltà di ottenere regioisomeri e enantiomeri puri, bassi rendimenti e vaste (e costose) purifiche. Qui, presentiamo un'efficiente sintesi enzimatica di 19(S), 20 (R)- e 16(S), 17(R)-epoxydocosatrapaenoiche acids (EDP) da DHA via epossidazione con BM3, un enzima batterico CYP450 isolato originariamente da Bacillus megaterium (che è prontamente espresso in Escherichia coli). La caratterizzazione e la determinazione della purezza vengono eseguite con spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Questa procedura illustra i benefici della sintesi enzimatica dei metaboliti PUFA epoxy ed è applicabile all'epossidazione di altri acidi grassi, tra cui l'acido aracidonico (AA) e l'acido eicosapentaenoico (EPA) per produrre l'analogo epoxyeicosanoico acidi (EET) e gli acidi epossidicosaetui (EEQ), rispettivamente.
Introduzione
Come interesse per il ruolo che gli acidi grassi polinsaturi (in particolare gli acidi grassi polinsaturi omega-3 e omega-6) è cresciuto negli ultimi anni, i ricercatori hanno preso atto della vasta gamma di vantaggi interessanti che i loro metaboliti mostra. In particolare, i metaboliti dell'acido grasso epossidico prodotti dalla classe citocromatica P450 degli enzimi sono stati un grande punto focale. Ad esempio, molti epossido di PUFA, tra cui gli acidi epossieicosachichi (EET), gli acidi epoxydocosatrapaenoici (EDP) e gli acidi epossirossitetraenoici (EEQ), svolgono un ruolo critico nella regolazione della pressione sanguigna e dell'infiammazione....
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Protocollo
AVVISO: Consultare tutte le schede tecniche di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima di utilizzare le sostanze chimiche elencate.
1. Espressione di tipo selvaggio BM3
- Inoculare pBS-BM3 trasinfezione DH5 E. coli (una generosa donazione dal Dr. F. Ann Walker) in 5 mL di brodo LB sterile con 0,5 mg di ampicillina aggiunto in un tubo di coltura 20 mL.
- Incubare la coltura cellulare in uno shaker a 37 gradi centigradi per 24 h a 200 giri/min. Aggiungere la coltura di avviamento notturno (5 mL) e 100 mg di ampicillina a 1 L di brodo Sterile LB in un pallone Fernbach o Erlenmeyer. Agitare a 37 gradi centigradi....
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Risultati
Il cromatogramma della colonna flash (eseguito utilizzando un sistema di purificazione flash automatizzato come descritto di seguito) ottenuto dopo la purificazione della miscela grezza dall'epossidiva esossimatica ezimatica è mostrato nella Figura 1. Dopo l'esterificazione e la separazione dei regioisori, sono stati ottenuti i puri 16(S),17(R)-EDP e 19(S),20(R)-EDP esters metil. In genere, sono presenti in un rapporto appr.......
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Discussione
Vi presentiamo qui un metodo operativamente semplice ed economico per preparare i due metaboliti epossidici più abbondanti del DHA - 19,20 e 16,17-EDP. Questi acidi grassi epossidici possono essere preparati in forma altamente enantiopure (come il loro S,R-isomers) utilizzando l'enzima BM3 di tipo selvatico. Diversi punti critici che possono essere utilizzati per la risoluzione dei problemi, e l'estensione del nostro metodo per la preparazione di metaboliti epossidi enantiopure di AA ed EPA, sono descritti di se.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è finanziato da R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) e fondi di avvio dalla Michigan State University. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jun Yang (Università della California a Davis) e Lalitha Karchalla (Michigan State University) per l'assistenza con l'ottimizzazione della reazione enzimatica, e il Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectromometria e Metabolomics Facility) per assistenza con l'acquisizione dei dati HRMS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Bicarbonato di ammonio | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillina | GoldBio | A30125 | NA |
| Solfato di magnesio anidro | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Metanolo anidro | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Solfato di sodio anidro | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anidro toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Acido arachidonico (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Sensibile all'aria. |
| Etere dietilico | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (grado di biologia molecolare) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Acido docosaesaenoico (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Sensibile all'aria. |
| EDTA (acido etilendiamminotetraacetico) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Acido eicosapentaenoico (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Sensibile all'aria. |
| Acetato di etile | Sigma | 34858 | NA |
| Cartucce per colonne Flash da 25, 40, 4, 12 g Fisher | Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | In alternativa, è possibile utilizzare la cromatografia convenzionale su colonna |
| Acido formico (grado HPLC) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glicerolo | Sigma | G7757 | NA |
| Esani | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Brodo | Sigma | L3022 | NA |
| Idrossido di litio | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Cloruro di magnesio | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Metanolo (grado HPLC) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Sale tetrasodico | Sigma-Aldrich | 481973 | sensibile all'aria. |
| Acido ossalico | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 trasfettato DH5&alfa; E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (fenilmetanosulfonilfluoruro) | Sigma | P7626 | Tossico! |
| Permanganato di potassio | Sigma-Aldrich | 223468 | per la colorazione TLC. |
| Fosfato di potassio bibasico | Sigma | 795496 | NA |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma | 795488 | NA Q |
| Sepharose Resina a flusso rapido (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | Per la purificazione a scambio anionico dell'enzima |
| cloruro di sodio | Sigma | 71376 | NA |
| Tetraidrofurano, anidro | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazometano (2,0 M in esani) | Sigma-Aldrich | 362832 | Molto tossico. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Necessario anche: | |||
| Sistema di purificazione flash automatico (abbiamo usato un Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Centrifuga Agilent | ||
| capace di 10.000 x g | |||
| Colonna HPLC chirale (Lux cellulosa-3), 250 x 4,6 mm, 5 &; M, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| Forniture per la chimica generale: un imbuto separatore da 2 L, becher e palloni di Erlenmeyer con capacità di 1000-2000 L, fiale da 20 mL, fiale HPLC, piccoli palloni a fondo tondo e ancorette. | |||
| HPLC (utilizziamo una pompa analitica Shimadzu Prominence LC-20AT e un rivelatore UV-vis SPD-20A | Spettrofotometro Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000... | Thermo-Fisher Scientific NMR | ||
| NMR: Spettrometro Agilent DD2 (500 MHz) | |||
| Evaporatore rotante | Buchi | ||
| Dismembratore sonico o omogeneizzatore ad ultrasuoni | Cole-Parmer |
Riferimenti
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al.
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Ristampe e permessi
